數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用***定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到***的應(yīng)用，這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、**標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)...

industryTemplate對模板量要求高，過多會導(dǎo)致無法定量，過少會導(dǎo)致信號過低。四川數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢：（1）***定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線，定量結(jié)果...

數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國 Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測方式的BEAMing dPCR 檢測服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時間和耗材成本嚴(yán)重限制了...

近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的比較好契機(jī)。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用納升級芯片進(jìn)行單克隆模板PCR擴(kuò)增，獲得了美國專利，更重要的是這種采用“電浸潤法”進(jìn)行納升級芯片制造技術(shù)顯露雛形。伴隨二代測序技術(shù)發(fā)展起來的“油包水PCR”技術(shù)，可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。對干擾分子（背景信號、PCR抑制劑等）耐受度高，通過信號的“有”“無”定量而不是Ct值。北京重現(xiàn)性數(shù)字PCR方...

數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國 Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測方式的BEAMing dPCR 檢測服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時間和耗材成本嚴(yán)重限制了...

數(shù)字PCR可以直接計算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的***定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時*判斷有/無兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響**降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力**提高；數(shù)字PCR實驗中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCRddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，...

數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（divide and conquer），這種做法非常類似于計算機(jī)科學(xué)中的“分治算法”，將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。微反應(yīng)單元體積越均一穩(wěn)定、數(shù)量相對越多，定量的整體精度就越高。山東數(shù)字PCR口碑推薦甲基化分析：DNA甲基化是哺乳動物DNA的一種常見表...

CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。*****的伴隨診斷：常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實現(xiàn)**標(biāo)記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，K...

2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)， 這也是目前數(shù)字PCR市場上***型號的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個單獨的反應(yīng)孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持完全隔離 ，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操作步驟。同時芯片式設(shè)計避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題。作為Life-technologies在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，值得一提的是，這個全新的系統(tǒng)在設(shè)計理念上綜合考慮了系統(tǒng)穩(wěn)定性與運行成本因素，直接反映了該系統(tǒng)“適合所有分子生物學(xué)實驗室使用...

甲基化分析：DNA甲基化是哺乳動物DNA的一種常見表觀遺傳修飾，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中的基因表達(dá)從而在發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。異常的DNA甲基化涉及整個基因組的整體低甲基化和位于基因啟動子區(qū)域和基因間DNA的CpG島的局部超甲基化，這是人類惡性**中一個常見的表觀遺傳改變。基于PCR的方法已經(jīng)被***的應(yīng)用于DNA甲基化的評估，其原理是先采用亞硫酸氫鹽來處理DNA，這會通過脫氨基作用將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，然后設(shè)計與這些DNA進(jìn)行特異結(jié)合的引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增檢測。然而，傳統(tǒng)的PCR檢測容易受到PCR抑制劑的影響，在非甲基化等位基因的背景下進(jìn)行稀有甲基化等位基因檢測的敏感性有限。而數(shù)...

PCR擴(kuò)增效率的高低直接影響**終信號的判讀和實驗結(jié)果分析。在進(jìn)行熱循環(huán)實驗時，需檢查樣品的密封性以及PCR反應(yīng)板是否和PCR儀熱蓋完全接觸，確保PCR過程中樣品反應(yīng)液沒有蒸發(fā)。QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)采用**的微反應(yīng)腔室封閉方式，固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過程中微反應(yīng)體系的水分蒸發(fā)，確保微反應(yīng)體系中樣本反應(yīng)液濃度的恒定，更易實現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽性信號與陰性背景之間存在許多弱陽性信號。因此需要對引物探針進(jìn)行重新設(shè)計和優(yōu)化（詳見引物探針優(yōu)化設(shè)計）或提升退火溫度（探針通常比引物高5~10℃），以消除疑似熒光信號的“雨區(qū)“現(xiàn)象；此外，陽性信號和陰性背景間隙過小，...

微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一個實現(xiàn)低成本、小體積和高通量平行PCR分析的理想平臺。2000年，Unger等采用多層軟刻蝕 ( multilayer soft lithography，MSL) 技術(shù)在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上設(shè)計并加工高密度微泵微閥結(jié)構(gòu)(如圖2b所示) ，他們將這種芯片稱為IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高彈性的特點，通過多層軟刻蝕技術(shù)在芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，可以快速并準(zhǔn)確地將流體分成若干個**的單元，進(jìn)行多步平行反應(yīng)。2006 年Otte...

雖然數(shù)字PCR的優(yōu)勢與臨床應(yīng)用前景已在許多研究中得到確認(rèn)，但想要進(jìn)一步在臨床廣泛應(yīng)用，數(shù)字PCR需要針對以下幾個方面進(jìn)行升級：商用數(shù)字PCR系統(tǒng)需要進(jìn)一步提升樣本檢測通量以充分滿足COVID-19普篩的需求；需要制定國家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；需要產(chǎn)業(yè)界進(jìn)一步降低設(shè)備成本；基于數(shù)字PCR的**檢測試劑盒需要經(jīng)過嚴(yán)格多中心評價，并獲得NMPA、FDA、CE等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)證。隨著科研和產(chǎn)業(yè)的持續(xù)研發(fā)和投入，未來數(shù)字PCR將在實驗室或醫(yī)院得到更多的應(yīng)用，用于解決科研和臨床問題，提供更準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。數(shù)字PCR有望成為下一代分子診斷的**技術(shù)。低豐度DNA模板分子的精確定量。山東高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富數(shù)字...

液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術(shù)，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級液滴中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，收集破乳后進(jìn)行測序。通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應(yīng)體系，比微孔板和 IFC 系統(tǒng)更容易實現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。Vogelstein 及其同事提出的 BEAMing 技術(shù)就是一種基于乳液PCR的數(shù)字PCR系統(tǒng)。Lu 等也采用 BEAMing 和連接酶反應(yīng)實現(xiàn)對 mRNA 的定量分析。Zhou 等在 BEAMing...

industryTemplate常見的300種人、小鼠和大鼠基因表達(dá)Assay均已在QIAcuity數(shù)字PCR平臺上經(jīng)過驗證。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多...

可以使用幾種不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標(biāo)分子存在于單個液滴中的可能性。同時，從公式也可以看出，隨著反應(yīng)陽性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)相對于X會有較大的差距，隨著X的持續(xù)增加，數(shù)字PCR結(jié)果的不確定度也隨著提高，總體來說，數(shù)字PCR陽性體系的數(shù)量不得超過總體系數(shù)量的80%。另一個方面，N的增加會使整個數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高...

甲基化分析：DNA甲基化是哺乳動物DNA的一種常見表觀遺傳修飾，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中的基因表達(dá)從而在發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。異常的DNA甲基化涉及整個基因組的整體低甲基化和位于基因啟動子區(qū)域和基因間DNA的CpG島的局部超甲基化，這是人類惡性**中一個常見的表觀遺傳改變?；赑CR的方法已經(jīng)被***的應(yīng)用于DNA甲基化的評估，其原理是先采用亞硫酸氫鹽來處理DNA，這會通過脫氨基作用將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，然后設(shè)計與這些DNA進(jìn)行特異結(jié)合的引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增檢測。然而，傳統(tǒng)的PCR檢測容易受到PCR抑制劑的影響，在非甲基化等位基因的背景下進(jìn)行稀有甲基化等位基因檢測的敏感性有限。而數(shù)...

cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系統(tǒng)以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系統(tǒng)為**。Bio Mark系統(tǒng)采用微泵閥式芯片，以聚二甲基硅氧烷為芯片材料，主要依靠微流控通道與閥門的開閉進(jìn)行原始體系分割，在芯片的反應(yīng)倉進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個通孔的熒光信號，進(jìn)行目的序列含量的計算。QuantStudio 3D系統(tǒng)采用陣列微池式芯片，反應(yīng)液由進(jìn)樣孔直接進(jìn)入各微反應(yīng)池。芯片式dPCR生成微滴體積均一，具有較高的穩(wěn)定性，體系之間影響較小，但技術(shù)操作復(fù)雜，通量有限且實驗成本較高。定量方法不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值。山東PC...

20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)***定量分析。開發(fā)多靶點檢測的多重數(shù)字PCR檢測，可以通過多種熒光染料或...

cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系統(tǒng)以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系統(tǒng)為**。Bio Mark系統(tǒng)采用微泵閥式芯片，以聚二甲基硅氧烷為芯片材料，主要依靠微流控通道與閥門的開閉進(jìn)行原始體系分割，在芯片的反應(yīng)倉進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個通孔的熒光信號，進(jìn)行目的序列含量的計算。QuantStudio 3D系統(tǒng)采用陣列微池式芯片，反應(yīng)液由進(jìn)樣孔直接進(jìn)入各微反應(yīng)池。芯片式dPCR生成微滴體積均一，具有較高的穩(wěn)定性，體系之間影響較小，但技術(shù)操作復(fù)雜，通量有限且實驗成本較高。PCR 擴(kuò)增和熒光信號分析。湖北熒光信號數(shù)字...

20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)***定量分析。肺*T790M突變-cfDNA動態(tài)監(jiān)測。天津拷貝數(shù)變異數(shù)字...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展。特別是90年代后期，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。盡管經(jīng)過十幾年時間的迅速發(fā)展，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷，但是，在 PCR擴(kuò)增過程中影響其擴(kuò)增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過程中擴(kuò)增效率保持不變和實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及...

為確保實驗順利進(jìn)行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶，利用小分子鎖扣 (Guard molecular) 將DNA聚合酶與抗體緊密結(jié)合形成雙保險，使其室溫條件下失活，只有通過95℃高溫2分鐘才能開啟小分子鎖扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計算的前提。樣本反應(yīng)液在進(jìn)行液滴分散過程中由于液體表面張力、操作不當(dāng)?shù)扔绊懀瑢?dǎo)致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導(dǎo)致有效分區(qū)數(shù)量變少更增加了交叉污染的風(fēng)險。因此，整個實驗過程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實驗操作。相...