數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無(wú)法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類(lèi)似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***臺(tái)商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國(guó) Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測(cè)方式的BEAMing dPCR 檢測(cè)服務(wù)，但這些方法無(wú)論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無(wú)法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時(shí)間和耗材成本嚴(yán)重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。外泌體里面的micRNA含量是非常低的。江蘇數(shù)字PCR專(zhuān)業(yè)服務(wù)
QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù) 開(kāi)發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，這也是**早出現(xiàn)的相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，在運(yùn)行成本和實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達(dá)到了商品化的標(biāo)準(zhǔn)。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購(gòu)，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號(hào)儀繼續(xù)在市場(chǎng)上銷(xiāo)售，這個(gè)早期型號(hào)為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級(jí)型號(hào)QX200。2012年，RainDance公司推出Raindrop型號(hào)數(shù)字PCR設(shè)備，這個(gè)設(shè)備將其原有的二代測(cè)序文庫(kù)制備平臺(tái)技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬(wàn)至1000萬(wàn)個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液， 該公司的創(chuàng)始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶(hù)“提供更高的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品”。江蘇核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR方案增加引物或探針的Tm值，從而實(shí)現(xiàn)更短的引物和探針設(shè)計(jì)。
使用不合適的引物可能會(huì)引入引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此，小Q建議您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需做以下幾個(gè)方面的檢查，***需對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，以確保引物的特異性！在數(shù)字PCR***定量實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于基因突變檢測(cè)、基因表達(dá)差異分析和拷貝數(shù)變異鑒定等對(duì)實(shí)驗(yàn)精細(xì)性要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要特異性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity數(shù)字PCR平臺(tái)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了針對(duì)上述常見(jiàn)應(yīng)用的700多組dPCR LNA Assay，所有Assay均經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾來(lái)增強(qiáng)其對(duì)互補(bǔ)序列的親和力和特異性，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用***定量的方式，不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到***的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、**標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。在gDNA長(zhǎng)度≥20kb或進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須對(duì)樣品進(jìn)行酶切處理。
CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿(mǎn)足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但精確定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。*****的伴隨診斷：常用體液來(lái)源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來(lái)源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過(guò)微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)**標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺*/胃*的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于**精細(xì)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。線(xiàn)粒體拷貝數(shù)分析與線(xiàn)粒體突變分析。江蘇數(shù)字PCR專(zhuān)業(yè)服務(wù)
微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計(jì)算的前提。江蘇數(shù)字PCR專(zhuān)業(yè)服務(wù)
數(shù)字PCR 的定量方法不依賴(lài)于擴(kuò)增曲線(xiàn)的循環(huán)閾值，因此不受擴(kuò)增效率的影響，也不必采用看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)***定量分析。在未來(lái)十年內(nèi)，醫(yī)學(xué)保健的目標(biāo)是提供質(zhì)量高效的個(gè)性化醫(yī)療。PCR 方法會(huì)在實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。相比于傳統(tǒng)的PCR，數(shù)字PCR 技術(shù)有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)和***的應(yīng)用前景。應(yīng)用領(lǐng)域：突變/稀有變異檢測(cè)（Mutation/Rare variant detection）拷貝數(shù)變異（Copy-number variation）進(jìn)入外周循環(huán)（包括血液和糞便）的**組織核酸分析無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查轉(zhuǎn)化移植檢測(cè)藥理學(xué)（Pharmacogenetics）基因表達(dá)分析（Geneexpression analysis）-特別針對(duì)單細(xì)胞或少量細(xì)胞或者血清血漿樣品線(xiàn)粒體拷貝數(shù)分析與線(xiàn)粒體突變分析數(shù)字PCR可以驗(yàn)證二代測(cè)序(NGS)。江蘇數(shù)字PCR專(zhuān)業(yè)服務(wù)