聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時(shí)間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。特別是90年代后期，美國(guó)ABI公司推出的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。盡管經(jīng)過十幾年時(shí)間的迅速發(fā)展，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營(yíng)養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷，但是，在 PCR擴(kuò)增過程中影響其擴(kuò)增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過程中擴(kuò)增效率保持不變和實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴(kuò)增效率是相同的，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。因此 qPCR 的定量只是“相對(duì)定量”，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。通過直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式計(jì)算得到樣品的原始濃度或含量。山東高精確度數(shù)字PCR方案
該技術(shù)提出至今雖然只有十幾年時(shí)間，但是由于其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，使得其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速。迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產(chǎn)品，并已經(jīng)應(yīng)用于單細(xì)胞分析、**早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域。目前，有關(guān)數(shù)字 PCR 技術(shù)的綜述類文獻(xiàn)并不多見，本文將在現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)該技術(shù)的原理、定量方法、分類及應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。數(shù)字 PCR 技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。迄今為止，數(shù)字 PCR 技術(shù)主要有三類: 微反應(yīng)室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。廣東高精確度數(shù)字PCR整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程可在2小時(shí)內(nèi)完成。
甲基化含量鑒定：傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測(cè)序法、抗體檢測(cè)法、定量PCR檢測(cè)法等受限于方法學(xué)的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過對(duì)樣品的微液滴處理及目標(biāo)分子的***拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測(cè)提供了一種可靠的技術(shù)。二代測(cè)序輔助建庫(kù)：目前靶向測(cè)序建庫(kù)方法包括擴(kuò)增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴(kuò)增引物增加時(shí)，由于擴(kuò)增引物之間的相互作用，從而影響擴(kuò)增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴(kuò)增，將可**降低引物間相互作用，提高擴(kuò)增效率。同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于少量模板的有效擴(kuò)增，得到更多的有效測(cè)序數(shù)據(jù)。
拷貝數(shù)變異(CNV)研究：數(shù)字PCR直接讀取陽(yáng)性信號(hào)，通過泊松分布校正得到目標(biāo)基因的***拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了***的檢測(cè)精度。采用數(shù)字PCR能夠有效對(duì)二代測(cè)序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并具有檢測(cè)周期短、成本低、樣本通量高等特點(diǎn)。低豐度DNA模板分子的精確定量：由于絕大部分微液滴中只含單個(gè)或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴(kuò)增不受高豐度模板分子擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)抑制：與此同時(shí)，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進(jìn)行了相對(duì)稀釋，作用于單個(gè)微液滴內(nèi)模板擴(kuò)增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴(kuò)增對(duì)抑制劑的耐受程度，因此可應(yīng)用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標(biāo)記物的檢測(cè)。一般而言，定量PCR的檢測(cè)靈敏度約在1%，NGS的靈敏度可達(dá)到1%，而數(shù)字PCR的檢測(cè)下限可輕松實(shí)現(xiàn)0.01%?？梢杂脕頇z測(cè)外泌體micRNA。
肺*的ALK融合基因檢測(cè)：ALK融合基因是NSCLC患者另外一個(gè)常規(guī)的伴隨診斷，可以指導(dǎo)ALK-TKI藥物的使用，目前已發(fā)現(xiàn)20種以上EML4-ALK的融合形式，多個(gè)報(bào)道證實(shí)它們中大部分能促進(jìn)**生成。另外ALK還可能與TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因發(fā)生融合，因此ALK融合突變的診斷具有一定難度。目前臨床常規(guī)使用的檢測(cè)手段包括免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）以及RT-PCR等三種。這三種方法各具優(yōu)缺點(diǎn)：IHC相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，但是容易受到主觀判斷的影響；FISH可以檢測(cè)各種融合類型，但是操作繁瑣，價(jià)格昂貴；RT-PCR方法的特異性較好，結(jié)果客觀，但是只能針對(duì)已知類型。近期有研究者采用數(shù)字PCR，利用ALK基因3’端的過表達(dá)來鑒定ALK的融合，該方法既具有PCR方法特異性好、結(jié)果客觀的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)又不受融合類型的限制，可以檢測(cè)所有融合型，在與三種傳統(tǒng)方法的對(duì)比過程中展現(xiàn)出了更好的臨床符合率，未來有望成為一種新的常規(guī)檢測(cè)手段。開發(fā)多靶點(diǎn)檢測(cè)的多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)，可以通過多種熒光染料或標(biāo)記技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。云南數(shù)字PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)
對(duì)引物的特異性要求高。山東高精確度數(shù)字PCR方案
CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但精確定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。*****的伴隨診斷：常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)**標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺*/胃*的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于**精細(xì)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。山東高精確度數(shù)字PCR方案