CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但精確定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。*****的伴隨診斷：常用體液來(lái)源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來(lái)源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過(guò)微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)**標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺*/胃*的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于**精細(xì)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷?？梢杂脕?lái)驗(yàn)證二代測(cè)序(NGS)。湖北熒光信號(hào)數(shù)字PCR歡迎咨詢
傳統(tǒng) PCR 或定量 PCR 反應(yīng)都是在96/384孔板中進(jìn)行的，因此早期的數(shù)字PCR技術(shù)也采用 96 /384孔板作為反應(yīng)單元。但是數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度取決于反應(yīng)單元的總數(shù)n，因此，理論上反應(yīng)單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準(zhǔn)確度，普通的96 /384孔板無(wú)法滿足檢測(cè)的需要。而且，在96 /384 孔板中進(jìn)行的PCR反應(yīng)體系通常大于5μl，由試劑消耗引起的高成本問(wèn)題令人望而卻步。針對(duì)上述問(wèn)題， Morrison 等在25mm×75mm不銹鋼芯片上刻蝕了3072個(gè)直徑為300μm的微反應(yīng)室(如圖2a所示)，每個(gè)反應(yīng)單元的體積降低至33 nl。該芯片可在商品化 PCR 儀上使用，與384 孔板的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)，但反應(yīng)體積降低為原來(lái)的1/64，樣品通量提高了24倍。隨著反應(yīng)單元數(shù)目的成倍增加，反應(yīng)體積從微升級(jí)降至納升級(jí)，傳統(tǒng)的操作人員采用移液器加試樣的方式已經(jīng)無(wú)法滿足快速精細(xì)取樣的要求，因此需要借助高通量自動(dòng)點(diǎn)樣儀或機(jī)械手等設(shè)備，這無(wú)疑大幅提高了系統(tǒng)的成本和操作的復(fù)雜性。熒光信號(hào)數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬(wàn)個(gè)單元中進(jìn)行反應(yīng)。
單細(xì)胞的基因表達(dá)分析：基因表達(dá)分析有助于了解細(xì)胞和組織的特征及其如何應(yīng)對(duì)發(fā)育和環(huán)境信號(hào)的改變。檢測(cè)已知和未知基因轉(zhuǎn)錄水平的方法在過(guò)去的四十多年來(lái)發(fā)生了翻天覆地的變化，變得更加有效，更加敏感，定量更加精細(xì)，能夠一次性對(duì)大量的基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。但是，在組成復(fù)雜的細(xì)胞混合物中，盡管***表達(dá)的基因可以被識(shí)別出來(lái)，但來(lái)自于少數(shù)細(xì)胞群體（例如干細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄本卻很可能會(huì)被掩蓋掉，尤其是在每個(gè)細(xì)胞中以低豐度形式出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本。為了解決這個(gè)問(wèn)題，單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用而生，而且逐漸受到了越來(lái)越多的重視。ddPCR在單細(xì)胞分析中的優(yōu)勢(shì)在于它不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線就能進(jìn)行***定量。而且，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉(zhuǎn)錄本，因此無(wú)需進(jìn)行其他方法所要求的單細(xì)胞cDNA預(yù)擴(kuò)增，這可以消除預(yù)擴(kuò)增和NGS文庫(kù)準(zhǔn)備中潛在的轉(zhuǎn)錄本定量失真，能夠能加真實(shí)的反映單細(xì)胞群體中關(guān)鍵基因的特征。
微小殘留病變（minimalresidualdisease，MRD）：隨著化療、靶向***、造血干細(xì)胞移植等***方式的改進(jìn)，血液**的***效果日益改善。微小殘留?。∕RD）導(dǎo)致的復(fù)發(fā)是目前血液*****的一大難題。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MRD對(duì)于評(píng)價(jià)***療效、預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)、實(shí)施個(gè)體化***具有重要的指導(dǎo)意義。MRD檢測(cè)方法需滿足可定量、標(biāo)準(zhǔn)化、便捷性的要求。目前**常見(jiàn)的是流式細(xì)胞學(xué)（flowcytometry,FCM）和PCR兩大類,但只有靈敏度高于10-4才能被納入標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估。數(shù)字PCR技術(shù)，其有限稀釋的特點(diǎn)可降低復(fù)雜的背景干擾，濃縮低豐度目的基因信號(hào)，從而提高M(jìn)RD檢測(cè)的靈敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同時(shí)用dPCR和qPCR檢測(cè)了61名CML患者的外周血，這些患者在每3個(gè)月一次連續(xù)3次的qPCR檢測(cè)中，已經(jīng)檢測(cè)不到BCR-ABL，dPCR檢測(cè)到18%的患者是陽(yáng)性的。在隨后的隨訪中，dPCR能比qPCR提前幾個(gè)月檢測(cè)到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR檢測(cè)中，Drandi等在222例樣本中驗(yàn)證了dPCR和qPCR方法的一致性，還成功地將dPCR應(yīng)用于3例qPCR無(wú)法檢測(cè)的病例。數(shù)字PCR作為目前靈敏度和準(zhǔn)確性比較高的分子檢測(cè)方法，非常適用于微小殘留病變?cè)u(píng)估。目前有超過(guò)130萬(wàn)條經(jīng)鎖核酸修飾的引物，提供至少3種設(shè)計(jì)方案以滿足不同跨外顯子區(qū)域的檢測(cè)需求。
可以使用幾種不同的方法來(lái)分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過(guò)假設(shè)分子種群遵循泊松分布來(lái)估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過(guò)公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。同時(shí)，從公式也可以看出，隨著反應(yīng)陽(yáng)性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)相對(duì)于X會(huì)有較大的差距，隨著X的持續(xù)增加，數(shù)字PCR結(jié)果的不確定度也隨著提高，總體來(lái)說(shuō)，數(shù)字PCR陽(yáng)性體系的數(shù)量不得超過(guò)總體系數(shù)量的80%。另一個(gè)方面，N的增加會(huì)使整個(gè)數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應(yīng)的靈敏度、穩(wěn)定性以及可重復(fù)性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情況下，增加分配的腔室數(shù)和液滴數(shù)?？梢杂脕?lái)檢測(cè)外泌體micRNA。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR歡迎咨詢
近年來(lái)，Bio-Rad、凱杰、賽默飛等巨頭公司紛紛通過(guò)收購(gòu)、投資等方式布局?jǐn)?shù)字PCR業(yè)務(wù)。湖北熒光信號(hào)數(shù)字PCR歡迎咨詢
微生物（病毒、細(xì)菌等）的檢測(cè)：疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗(yàn)檢疫局系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室可以將基于TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR體系無(wú)縫地轉(zhuǎn)移到數(shù)字PCR上，從而滿足該類實(shí)驗(yàn)室對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的***定量結(jié)果。其他應(yīng)用：數(shù)字PCR還可以用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)、移植排斥監(jiān)控、腸道菌群分析以及藥物基因組檢測(cè)等領(lǐng)域。隨著數(shù)字PCR熒光通道的增加和多指標(biāo)檢測(cè)的成熟，數(shù)字PCR將會(huì)進(jìn)入更多應(yīng)用領(lǐng)域，有力推動(dòng)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。湖北熒光信號(hào)數(shù)字PCR歡迎咨詢