微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一個(gè)實(shí)現(xiàn)低成本、小體積和高通量平行PCR分析的理想平臺(tái)。2000年，Unger等采用多層軟刻蝕 ( multilayer soft lithography，MSL) 技術(shù)在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上設(shè)計(jì)并加工高密度微泵微閥結(jié)構(gòu)(如圖2b所示) ，他們將這種芯片稱為IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高彈性的特點(diǎn)，通過(guò)多層軟刻蝕技術(shù)在芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，可以快速并準(zhǔn)確地將流體分成若干個(gè)**的單元，進(jìn)行多步平行反應(yīng)。2006 年Ottesen等將IFC芯片用于數(shù)字PCR分析，通過(guò)精細(xì)控制微泵微閥的開(kāi)啟和關(guān)閉，一步操作即可將一個(gè)樣本平均分配到 1176個(gè)反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元的體積只有6. 25 nl，成功代替了傳統(tǒng)點(diǎn)樣儀和384孔板。他們同時(shí)進(jìn)行了6個(gè)樣本7 056個(gè)單元的平行數(shù)字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技術(shù)加工了具有10^6個(gè)結(jié)構(gòu)單元的數(shù)字PCR 芯片，每個(gè)反應(yīng)單元的體積降低至10 pl，芯片密度達(dá)到 440000 /cm2。與微反應(yīng)室數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，IFC的特點(diǎn)是通量更高，每個(gè)反應(yīng)單元的體積更小，加樣更快。**近，Men等在2mm×2mm區(qū)域內(nèi)加工了82000個(gè) fl 級(jí)反應(yīng)單元，進(jìn)行數(shù)字PCR分析。DNA聚合酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作
ddPCR主要有Bio-rad公司開(kāi)發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬(wàn)個(gè)微滴，Rain Drop可以分割成100萬(wàn)-1 000萬(wàn)個(gè)微滴。ddPCR原理是通過(guò)將一個(gè)待分析的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個(gè)油包水小微滴從而對(duì)原始體系進(jìn)行分割，樣品中的核酸分子隨機(jī)分配到大量**的微滴中，每個(gè)微滴中含有一個(gè)或不含待檢核酸分子。對(duì)微滴體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以后，分析每個(gè)微滴的熒光信號(hào)，進(jìn)行有或無(wú)的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過(guò)讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，也保證一定程度上的微滴檢測(cè)穩(wěn)定性。湖北準(zhǔn)確數(shù)字PCR活動(dòng)良好的引物探針設(shè)計(jì)是數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)獲得成功的關(guān)鍵因素之一。
20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來(lái)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)***定量分析。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時(shí)間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。特別是90年代后期，美國(guó)ABI公司推出的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。盡管經(jīng)過(guò)十幾年時(shí)間的迅速發(fā)展，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營(yíng)養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷，但是，在 PCR擴(kuò)增過(guò)程中影響其擴(kuò)增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過(guò)程中擴(kuò)增效率保持不變和實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴(kuò)增效率是相同的，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。因此 qPCR 的定量只是“相對(duì)定量”，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對(duì)廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測(cè)方法，我們?cè)诳创龜?shù)字PCR的應(yīng)用前景時(shí)，更應(yīng)該保持一種開(kāi)放的心態(tài)，與其說(shuō)數(shù)字PCR技術(shù)是一個(gè)新的檢測(cè)平臺(tái)，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個(gè)平臺(tái)上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢(shì)：（1）***定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線，定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；（2）高靈敏度，可實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)檢測(cè)；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對(duì)罕見(jiàn)的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)；（4）高穩(wěn)定性，對(duì)抑制劑的耐受程度**增強(qiáng)。憑借這些優(yōu)勢(shì)，數(shù)字PCR被廣泛應(yīng)用于多個(gè)不同的領(lǐng)域[4]，特別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括稀有突變檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)、基因表達(dá)研究、甲基化水平檢測(cè)、**液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)、微生物（病毒、細(xì)菌等）檢測(cè)、移植排斥監(jiān)控和二代測(cè)序輔助建庫(kù)等。此外，此技術(shù)也被用于農(nóng)業(yè)、食品安全和環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域。市場(chǎng)想象空間大，國(guó)內(nèi)外入局者眾多。重現(xiàn)性數(shù)字PCR歡迎咨詢
基因豐度非常低的，或者樣本濃度低的，可以選擇數(shù)字化PCR。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作
（5）在SARS-CoV-2核酸參考品制備中，數(shù)字PCR能夠?qū)怂徇M(jìn)行精確的定量，能夠提高世界各國(guó)SARS-CoV-2核酸測(cè)量結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。（6）數(shù)字PCR能夠靈敏檢測(cè)與定量環(huán)境中的病毒RNA濃度，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本（如公共區(qū)域、病房、醫(yī)院衛(wèi)生間、實(shí)驗(yàn)室操作員手套、廢水等等）。（7）在實(shí)驗(yàn)室樣品與臨床樣品病毒突變檢測(cè)中，數(shù)字PCR適合用于已知的SARS-CoV-2遺傳變異檢測(cè)，特別是對(duì)于一些低頻突變。（8）在抗病毒藥物的研發(fā)過(guò)程中，病毒載量的變化是評(píng)估藥物有效性的重要指標(biāo)，借由數(shù)字PCR提供的***定量結(jié)果，能夠給出更具說(shuō)服力和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)結(jié)果。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作