可以使用幾種不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標分子存在于單個液滴中的可能性。同時，從公式也可以看出，隨著反應陽性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標分子的拷貝數(shù)相對于X會有較大的差距，隨著X的持續(xù)增加，數(shù)字PCR結果的不確定度也隨著提高，總體來說，數(shù)字PCR陽性體系的數(shù)量不得超過總體系數(shù)量的80%。另一個方面，N的增加會使整個數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應的靈敏度、穩(wěn)定性以及可重復性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情況下，增加分配的腔室數(shù)和液滴數(shù)。影響引物探針特異性的因素有很多種，譬如純化方式、設計方法以及引物探針的修飾技術等。北京數(shù)字PCR方案
數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（divide and conquer），這種做法非常類似于計算機科學中的“分治算法”，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應器比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。四川高靈敏度數(shù)字PCR共同合作近年來，Bio-Rad、凱杰、賽默飛等巨頭公司紛紛通過收購、投資等方式布局數(shù)字PCR業(yè)務。
肺*的ALK融合基因檢測：ALK融合基因是NSCLC患者另外一個常規(guī)的伴隨診斷，可以指導ALK-TKI藥物的使用，目前已發(fā)現(xiàn)20種以上EML4-ALK的融合形式，多個報道證實它們中大部分能促進**生成。另外ALK還可能與TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因發(fā)生融合，因此ALK融合突變的診斷具有一定難度。目前臨床常規(guī)使用的檢測手段包括免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）以及RT-PCR等三種。這三種方法各具優(yōu)缺點：IHC相對簡單，價格低廉，但是容易受到主觀判斷的影響；FISH可以檢測各種融合類型，但是操作繁瑣，價格昂貴；RT-PCR方法的特異性較好，結果客觀，但是只能針對已知類型。近期有研究者采用數(shù)字PCR，利用ALK基因3’端的過表達來鑒定ALK的融合，該方法既具有PCR方法特異性好、結果客觀的優(yōu)勢，同時又不受融合類型的限制，可以檢測所有融合型，在與三種傳統(tǒng)方法的對比過程中展現(xiàn)出了更好的臨床符合率，未來有望成為一種新的常規(guī)檢測手段。
從上世紀90年代以來qPCR技術的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測技術具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術正在迅速發(fā)展，也是目前競爭**為激烈的研究領域之一，即使在這種情況下，dPCR技術仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學領域爭取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應用領域，也有一些實驗室同時選擇dPCR平臺進行平行實驗以保證實驗結果的準確和可重復性。在基因組變異研究領域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反應嚴重影響突變序列的檢測精度，數(shù)字PCR技術帶來的極高的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在**標志物檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。微反應單元體積越均一穩(wěn)定、數(shù)量相對越多，定量的整體精度就越高。
ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應體系進行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量**的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內參核酸的陽性微滴個數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現(xiàn)高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩(wěn)定性。高精確度、高靈敏度，熒光定量qPCR靈敏度為1%-0.1%，數(shù)字化PCR靈敏度可達0.01-0.001%。江蘇高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富
對模板量要求高，過多會導致無法定量，過少會導致信號過低。北京數(shù)字PCR方案
為確保實驗順利進行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶，利用小分子鎖扣 (Guard molecular) 將DNA聚合酶與抗體緊密結合形成雙保險，使其室溫條件下失活，只有通過95℃高溫2分鐘才能開啟小分子鎖扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴增現(xiàn)象。微反應單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準確計算的前提。樣本反應液在進行液滴分散過程中由于液體表面張力、操作不當?shù)扔绊懀瑢е缕洳糠职l(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導致有效分區(qū)數(shù)量變少更增加了交叉污染的風險。因此，整個實驗過程需嚴格按照標準流程進行實驗操作。相較于液滴式分區(qū)，QIAcuity數(shù)字PCR搭配的Nanoplate采用**納米微孔設計，利用微流體技術將數(shù)字PCR反應體系分配到大小均一且固定微孔中，并在分區(qū)完成后自動封閉所有微孔聯(lián)通管道，真正意義上實現(xiàn)**均一的微反應體系。北京數(shù)字PCR方案