可以使用幾種不同的方法來(lái)分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過(guò)假設(shè)分子種群遵循泊松分布來(lái)估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過(guò)公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。同時(shí)，從公式也可以看出，隨著反應(yīng)陽(yáng)性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)相對(duì)于X會(huì)有較大的差距，隨著X的持續(xù)增加，數(shù)字PCR結(jié)果的不確定度也隨著提高，總體來(lái)說(shuō)，數(shù)字PCR陽(yáng)性體系的數(shù)量不得超過(guò)總體系數(shù)量的80%。另一個(gè)方面，N的增加會(huì)使整個(gè)數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應(yīng)的靈敏度、穩(wěn)定性以及可重復(fù)性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情況下，增加分配的腔室數(shù)和液滴數(shù)。影響引物探針特異性的因素有很多種，譬如純化方式、設(shè)計(jì)方法以及引物探針的修飾技術(shù)等。北京數(shù)字PCR方案
數(shù)字PCR采用的策略概括起來(lái)非常簡(jiǎn)單，就是“分而治之”（divide and conquer），這種做法非常類似于計(jì)算機(jī)科學(xué)中的“分治算法”，將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)陽(yáng)性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。在實(shí)際的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中，事實(shí)上是通過(guò)呈現(xiàn)兩種信號(hào)類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。四川高靈敏度數(shù)字PCR共同合作近年來(lái)，Bio-Rad、凱杰、賽默飛等巨頭公司紛紛通過(guò)收購(gòu)、投資等方式布局?jǐn)?shù)字PCR業(yè)務(wù)。
肺*的ALK融合基因檢測(cè)：ALK融合基因是NSCLC患者另外一個(gè)常規(guī)的伴隨診斷，可以指導(dǎo)ALK-TKI藥物的使用，目前已發(fā)現(xiàn)20種以上EML4-ALK的融合形式，多個(gè)報(bào)道證實(shí)它們中大部分能促進(jìn)**生成。另外ALK還可能與TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因發(fā)生融合，因此ALK融合突變的診斷具有一定難度。目前臨床常規(guī)使用的檢測(cè)手段包括免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）以及RT-PCR等三種。這三種方法各具優(yōu)缺點(diǎn)：IHC相對(duì)簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，但是容易受到主觀判斷的影響；FISH可以檢測(cè)各種融合類型，但是操作繁瑣，價(jià)格昂貴；RT-PCR方法的特異性較好，結(jié)果客觀，但是只能針對(duì)已知類型。近期有研究者采用數(shù)字PCR，利用ALK基因3’端的過(guò)表達(dá)來(lái)鑒定ALK的融合，該方法既具有PCR方法特異性好、結(jié)果客觀的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)又不受融合類型的限制，可以檢測(cè)所有融合型，在與三種傳統(tǒng)方法的對(duì)比過(guò)程中展現(xiàn)出了更好的臨床符合率，未來(lái)有望成為一種新的常規(guī)檢測(cè)手段。
從上世紀(jì)90年代以來(lái)qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測(cè)技術(shù)具有全新的面貌，而進(jìn)入二十一世紀(jì)之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測(cè)序技術(shù)正在迅速發(fā)展，也是目前競(jìng)爭(zhēng)**為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭(zhēng)取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應(yīng)用領(lǐng)域，也有一些實(shí)驗(yàn)室同時(shí)選擇dPCR平臺(tái)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和可重復(fù)性。在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測(cè)面臨的問(wèn)題主要是突變序列往往與大量正常序列同時(shí)存在，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)嚴(yán)重影響突變序列的檢測(cè)精度，數(shù)字PCR技術(shù)帶來(lái)的極高的擴(kuò)增特異性在稀有突變檢測(cè)方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，在**標(biāo)志物檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測(cè)等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。微反應(yīng)單元體積越均一穩(wěn)定、數(shù)量相對(duì)越多，定量的整體精度就越高。
ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬(wàn)個(gè)微滴，Rain Drop可以分割成100萬(wàn)-1 000萬(wàn)個(gè)微滴。ddPCR原理是通過(guò)將一個(gè)待分析的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個(gè)油包水小微滴從而對(duì)原始體系進(jìn)行分割，樣品中的核酸分子隨機(jī)分配到大量**的微滴中，每個(gè)微滴中含有一個(gè)或不含待檢核酸分子。對(duì)微滴體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以后，分析每個(gè)微滴的熒光信號(hào)，進(jìn)行有或無(wú)的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過(guò)讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，也保證一定程度上的微滴檢測(cè)穩(wěn)定性。高精確度、高靈敏度，熒光定量qPCR靈敏度為1%-0.1%，數(shù)字化PCR靈敏度可達(dá)0.01-0.001%。江蘇高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富
對(duì)模板量要求高，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致無(wú)法定量，過(guò)少會(huì)導(dǎo)致信號(hào)過(guò)低。北京數(shù)字PCR方案
為確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，QIAcuity EG PCR Kit和Probe PCR Kit均采用**抗體修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，利用小分子鎖扣 (Guard molecular) 將DNA聚合酶與抗體緊密結(jié)合形成雙保險(xiǎn)，使其室溫條件下失活，只有通過(guò)95℃高溫2分鐘才能開啟小分子鎖扣，***DNA聚合酶活性，有效避免了非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計(jì)算的前提。樣本反應(yīng)液在進(jìn)行液滴分散過(guò)程中由于液體表面張力、操作不當(dāng)?shù)扔绊?，?dǎo)致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導(dǎo)致有效分區(qū)數(shù)量變少更增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。相較于液滴式分區(qū)，QIAcuity數(shù)字PCR搭配的Nanoplate采用**納米微孔設(shè)計(jì)，利用微流體技術(shù)將數(shù)字PCR反應(yīng)體系分配到大小均一且固定微孔中，并在分區(qū)完成后自動(dòng)封閉所有微孔聯(lián)通管道，真正意義上實(shí)現(xiàn)**均一的微反應(yīng)體系。北京數(shù)字PCR方案