甲基化分析：DNA甲基化是哺乳動(dòng)物DNA的一種常見表觀遺傳修飾，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中的基因表達(dá)從而在發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。異常的DNA甲基化涉及整個(gè)基因組的整體低甲基化和位于基因啟動(dòng)子區(qū)域和基因間DNA的CpG島的局部超甲基化，這是人類惡性**中一個(gè)常見的表觀遺傳改變?；赑CR的方法已經(jīng)被***的應(yīng)用于DNA甲基化的評(píng)估，其原理是先采用亞硫酸氫鹽來處理DNA，這會(huì)通過脫氨基作用將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，然后設(shè)計(jì)與這些DNA進(jìn)行特異結(jié)合的引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。然而，傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)容易受到PCR抑制劑的影響，在非甲基化等位基因的背景下進(jìn)行稀有甲基化等位基因檢測(cè)的敏感性有限。而數(shù)字PCR是在無數(shù)個(gè)**的分隔之中進(jìn)行反應(yīng)，因此彼此之間較少受到抑制劑的影響，能夠?qū)鹘y(tǒng)方法檢測(cè)不到的罕見甲基化等位基因進(jìn)行精細(xì)的檢測(cè)，未來有望將DNA甲基化作為一個(gè)具有區(qū)域性*變的預(yù)測(cè)指標(biāo)或者**風(fēng)險(xiǎn)生物標(biāo)志物來使用?；趩畏肿涌焖貾CR擴(kuò)增，進(jìn)行核酸拷貝數(shù)定量的一種方法。PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)
*****的實(shí)時(shí)監(jiān)控：已有數(shù)篇文章報(bào)道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)患者***過程中的循環(huán)**DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺*、乳腺*和腸*等多種**患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctDNA突變及豐度改變通常會(huì)提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時(shí)調(diào)整***方案，使患者得到更有效的***。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查：唐氏綜合征、地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測(cè)等，目前無創(chuàng)檢測(cè)標(biāo)本來源主要為孕婦血液，檢測(cè)胎兒DNA會(huì)受到母體DNA的干擾，依靠數(shù)字PCR可提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。對(duì)比NGS，數(shù)字PCR技術(shù)可以提高工作效率、降低檢測(cè)成本。浙江拷貝數(shù)變異數(shù)字PCR共同合作通過鎖核酸修飾的引物增強(qiáng)了對(duì)互補(bǔ)序列的親和力和特異性，即使是微小表達(dá)差異也可以輕松檢測(cè)。
數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***臺(tái)商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國(guó) Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測(cè)方式的BEAMing dPCR 檢測(cè)服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時(shí)間和耗材成本嚴(yán)重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。
盡管dPCR被稱作第三代PCR技術(shù)，但dPCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用逐漸顯現(xiàn)出一些不足之處。通量不高、操作復(fù)雜，同時(shí)成本**增加，dPCR似乎還沒有找到相對(duì)qPCR足夠的不可取代性優(yōu)勢(shì)。另一方面，dPCR增加了很多技術(shù)難點(diǎn)，如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR擴(kuò)增，如何進(jìn)行靈敏的信號(hào)檢測(cè)和分析，如何提高自動(dòng)化程度，實(shí)現(xiàn)Sample-In Result-Out。相較于Digital ELISA能夠提高免疫檢測(cè)的靈敏度到fg/mL級(jí)別，實(shí)現(xiàn)了高敏蛋白的檢測(cè)，dPCR盡管發(fā)展更早，卻難以取得Killer Application，或許這也導(dǎo)致了所謂的第三代PCR在很多人看來卻沒那么“下一代”。通常CT值大于30的時(shí)候，熒光定量qPCR的精確度和重復(fù)性會(huì)**降低，這個(gè)時(shí)候可考慮數(shù)字化PCR。
20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實(shí)現(xiàn)***定量分析。低豐度DNA模板分子的精確定量。四川PCR數(shù)字PCR活動(dòng)
原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽性信號(hào)與陰性背景之間存在許多弱陽性信號(hào)。PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)
常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測(cè)定在各種條件上不會(huì)完全一致，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可以進(jìn)行***定量。dPCR也有一些缺點(diǎn)，數(shù)字PCR系統(tǒng)成本高，通量有限、操作繁瑣等不足。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系統(tǒng)復(fù)雜度高，使得商業(yè)化優(yōu)勢(shì)不是特別明顯，特別是目前大多數(shù)分子診斷qPCR也能夠很好的滿足需求，dPCR增加的收益成本比并不算高。液滴式相對(duì)芯片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR擴(kuò)增和檢測(cè)都分別在不同儀器中完成，增加了很多操作，也增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性，從這點(diǎn)上看全自動(dòng)熒光定量PCR做的更好。PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)