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    使MSI檢測(cè)的靈敏性、特異性和檢測(cè)的便利度都有了明顯進(jìn)步。3．錯(cuò)配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)與PCR-MSI檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)：文獻(xiàn)報(bào)道錯(cuò)配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)與PCR-MSI檢測(cè)結(jié)果的符合率非常高，達(dá)％，因此采用任何一種方法作為MSI-Hliu的篩查方法均可接受。相比之下，免疫組織化學(xué)法：(1)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快捷、穩(wěn)定，符合病理科日常工作流程，多數(shù)基層病理科均可開展；(2)所需組織量少，活檢標(biāo)本亦可檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果與切除標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果一致；(3)可直接提示發(fā)生缺陷的錯(cuò)配修復(fù)蛋白類型，對(duì)于后續(xù)進(jìn)行錯(cuò)配修復(fù)基因胚系突變檢測(cè)以確診Lynch綜合征有明確的指向性；(4)少數(shù)MSH6胚系突變病例的liu由于錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的功能冗余作用可不表現(xiàn)為MSI，但免疫組織化學(xué)可檢出蛋白表達(dá)缺失，因而可彌補(bǔ)PCR-MSI檢測(cè)方法的局限性。PCR-MSI檢測(cè)雖然相對(duì)復(fù)雜，費(fèi)用相對(duì)較高，但優(yōu)點(diǎn)是直接反映liu的MSI狀態(tài)，而且對(duì)于少數(shù)錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白功能異常但并不影響蛋白的轉(zhuǎn)錄和抗原性時(shí)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)可出現(xiàn)假陽(yáng)性，而PCR-MSI檢測(cè)正好可以彌補(bǔ)。四、***檢測(cè)MSI結(jié)直腸ai的必要性及推薦檢測(cè)流程區(qū)分MSI結(jié)直腸ai的臨床意義包括以下三個(gè)方面。1．提示預(yù)后：臨床研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ期結(jié)直腸ai中。方法簡(jiǎn)單易行，醫(yī)保覆蓋，適于臨床推廣。山東提供dMMR抗體檢測(cè)試劑創(chuàng)新服務(wù)

    1微衛(wèi)星（microsatellites）不穩(wěn)定性微衛(wèi)星（microsatellites）又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是存在于基因組中的一些小片段核苷酸的重復(fù)序列，重復(fù)單位一般由1~6個(gè)核苷酸組成，重復(fù)次數(shù)不超過60次，具有高突變性。DNA在復(fù)制過程中，尤其是微衛(wèi)星，可能會(huì)出現(xiàn)堿基錯(cuò)配等錯(cuò)誤，這些錯(cuò)誤累積起來(lái)并一代代的傳遞下去，**終會(huì)產(chǎn)生基因突變進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞ai變。這種在DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的一些簡(jiǎn)單重復(fù)序列的插入或缺失，被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatelliteinstability，MSI）[1]。2MSI與錯(cuò)配修復(fù)（MMR）蛋白間的關(guān)系DNA錯(cuò)配修復(fù)（Mismathrepair,MMR）系統(tǒng)由一系列特異性修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的酶分子(MMR蛋白）組成。MMR蛋白的主要功能是修復(fù)DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯(cuò)配，包括單堿基錯(cuò)配和2個(gè)以上的插入/缺失錯(cuò)配，從而保持遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性，避免遺傳物質(zhì)發(fā)生突變。據(jù)目前報(bào)道：涉及人類DNA錯(cuò)配修復(fù)的MMR蛋白主要有5個(gè)，其編碼基因分別為MLH1、PMS1、PMS2、MSH2和MSH6。MMR系統(tǒng)會(huì)對(duì)在DNA復(fù)制過程中的堿基錯(cuò)配等錯(cuò)誤進(jìn)行糾正，一旦修復(fù)系統(tǒng)失效，基因突變的風(fēng)險(xiǎn)便會(huì)提高。因此，MMR基因突變后，DNA復(fù)制時(shí)的過程中便會(huì)發(fā)生MSI[2,3]。3MSI判定標(biāo)準(zhǔn)MSI的檢測(cè)方法很多。上海推薦dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)覆蓋多個(gè)主流IHC自動(dòng)染色平臺(tái)，適用范圍廣。

    每孔加50μl含％abts(southernbiotech公司)和％h2o2的檸檬酸緩沖液()進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測(cè)定405nm波長(zhǎng)下的od值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為igg2b型鼠源單克隆抗體。二、親和常數(shù)測(cè)定包被msh6重組蛋白，包被濃度為2μg/ml,100μl/孔，4℃包被過夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封閉液37℃封閉2h，pbs-t洗3次。實(shí)施例4中純化的單克隆抗體，從1：200開始2倍梯度稀釋，***1孔留空白對(duì)照，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗1：20000稀釋，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl含％tmb(sigma公司)和％h2o2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色10min，加50μ。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。畫出od值對(duì)應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲線，找出≥1/2“平臺(tái)od值”對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)a。利用下列公式計(jì)算出親和常數(shù)為×109。三、單抗反應(yīng)特異性和應(yīng)用效果選擇msh6重組蛋白，用免疫印跡的方法檢測(cè)本發(fā)明單克隆抗體的識(shí)別特異性，免疫印跡實(shí)驗(yàn)過程如下：每種蛋白上樣約5-10ng，進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在bio-rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到pvdf膜上(millipore公司)。將膜置于含5％脫脂奶粉的tbs-t封閉液中4℃過夜。加入單克隆抗體msh6。

    SepulvedaAR等綜合眾多研究發(fā)現(xiàn)其他的RAS突變（包括KRAS3、4號(hào)外顯子及NRAS的2、3、4外顯子）的突變率約為。KRAS屬于RAS基因家族（HRAS，NRAS，KRAS）中的一員，編碼GTP/CDP結(jié)合蛋白，其作為EGFR下游信號(hào)通路的重要效應(yīng)分子，主要***RAF-MAPK通路進(jìn)行后續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控，在抗細(xì)胞調(diào)亡，介導(dǎo)**侵襲和轉(zhuǎn)移，乃至**引起的新血管生成中起作用。結(jié)直腸ai中約32%~40%的患者存在KRAS基因突變，存在KRAS突變的患者中約85%~90%的突變集中在第2號(hào)外顯子的12、13密碼子上，其余突變中約5%發(fā)生在61密碼子上，5%發(fā)生在146外顯子上。結(jié)腸直腸ai中KRAS基因的突變狀態(tài)對(duì)靶向***的選擇有著決定性的作用。CRYSTAL研究將西妥昔單抗聯(lián)合FOLFIRI方案化療對(duì)比單純化療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KRAS突變狀態(tài)與***反應(yīng)率相關(guān)，在RAS野生型的患者中，聯(lián)合組與單純化療組的ORR分別為（P＜），中位PFS分別為（P＜），中位OS分別為（P＜）。而在RAS突變型的患者中，西妥昔單抗的加入并未獲得生存優(yōu)勢(shì)，聯(lián)合組與單純化療組的ORR分別為（P=），中位PFS分別為（P=），中位OS分別為（P=）。新RAS突變的患者亦是如此，西妥昔單抗的加入同樣未取得生存獲益，聯(lián)合組與單純化療組的ORR分別為（P=）。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為生物標(biāo)志物研究和伴隨診斷開發(fā)提供科學(xué)支持，多層面助力新藥研發(fā)臨床試驗(yàn)。

    免疫組織化學(xué)的方法具有方便、快捷、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)并且對(duì)Lynch綜合征的確診具有指向性，因此被***接收，目前已幾乎替代前者。上述MSI的傳統(tǒng)檢測(cè)方法不能用于對(duì)Lynch綜合征的確診，而免疫組織化學(xué)方法因直接檢測(cè)相關(guān)蛋白對(duì)Lynch綜合征具有***的指向性。為了提高對(duì)Lynch綜合征的指向性，有學(xué)者建議將EpCAM列入錯(cuò)配修復(fù)蛋白檢測(cè)行列。然而對(duì)Lynch綜合征的確診必需依賴于對(duì)MLH1、MSH2、MSH6、PMS2以及EpCAM基因進(jìn)行突變或缺失的檢查結(jié)果。四、錯(cuò)配修復(fù)蛋白染色錯(cuò)配修復(fù)蛋白染色結(jié)果判斷應(yīng)注意以下幾點(diǎn):1）著色部位是否為核；2）內(nèi)對(duì)照（上皮細(xì)胞：正常腸上皮特別是腺體基底部細(xì)胞；間質(zhì)細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等）是否陽(yáng)性；3）**細(xì)胞的細(xì)胞核是否為陽(yáng)性（通常任何**細(xì)胞表達(dá)即判斷為該錯(cuò)配修復(fù)蛋白陽(yáng)性）錯(cuò)配修復(fù)蛋白結(jié)果解讀:一種或多種錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失提示為MSI-H**。通常MLH1功能缺陷會(huì)合并PMS2表達(dá)缺失，而MSH2缺陷則常合并MSH6表達(dá)缺失，反之不然。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)--伴隨診斷整體解決方案提供者,檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)全涵蓋.上海推薦dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

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    上述事實(shí)不斷警醒我國(guó)醫(yī)療從業(yè)者及衛(wèi)生決策者，要重視結(jié)直腸ai早期篩查預(yù)防及早診早治的價(jià)值。我國(guó)結(jié)直腸ai早診早治工作始于20世紀(jì)70年代，也并未落后于西方國(guó)家。但民眾對(duì)于結(jié)直腸ai的知曉情況、疾病相關(guān)知識(shí)科普情況，遠(yuǎn)落后于西方國(guó)家，這導(dǎo)致大量民眾不愿參與疾病篩查工作?；虺鲇趯?duì)自身健康的信心，或出于不愿花費(fèi)時(shí)間成本的心理，或單純出于諱疾忌醫(yī)的心態(tài)。這都源于對(duì)疾病過程、疾病后果及早期***意義的缺乏認(rèn)知。相關(guān)研究結(jié)果已經(jīng)證明：依從性仍是我國(guó)結(jié)直腸ai篩查面臨的主要問題之一。解決這一問題，有賴于從國(guó)民學(xué)齡期開始進(jìn)行的衛(wèi)生及健康宣傳教育、醫(yī)療模式**和篩查形式的改進(jìn)，如依托企事業(yè)、學(xué)校進(jìn)行單位健康體檢等。2.當(dāng)前篩查策略存在局限：我國(guó)缺乏統(tǒng)一、規(guī)范、大規(guī)模的前瞻性研究論證和總結(jié)當(dāng)前篩查策略及方案的優(yōu)劣。篩查方法方面，F(xiàn)OBT及FIT在靈敏度和特異度方面存在較大局限性。結(jié)腸鏡檢查為當(dāng)前結(jié)直腸ai進(jìn)行人群篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，因有侵入性及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，普查人群依從性較差，也成為限制篩查工作推廣的主要原因之一。結(jié)直腸ai篩查高危因素量化問卷具有我國(guó)特色，雖具備廉價(jià)、方便、易于***開展等優(yōu)勢(shì)，但其靈敏度及特異度低，*用于初篩。山東提供dMMR抗體檢測(cè)試劑創(chuàng)新服務(wù)