安徽定制dMMR抗體檢測試劑鄭重承諾

    使得微衛(wèi)星序列長度或堿基組成發(fā)生改變。MSI-H的患者為dMMR，MSI-L和MSS的患者為pMMR。目前推薦用于檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定的5個(gè)常用位點(diǎn)分別為BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346和D17S250，2個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定則稱為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）；l個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定稱為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-L）；0個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定則稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。微衛(wèi)星狀態(tài)與結(jié)腸ai臨床分期密切相關(guān)，在II期結(jié)直腸ai中，MSI-H/dMMR患者約占20%左右，在III期結(jié)直腸ai中約占12%，而在IV期中**少，約4%左右。1.微衛(wèi)星狀態(tài)在結(jié)腸ai中的預(yù)后作用從2000年Gryfe等發(fā)現(xiàn)Ⅰ~Ⅳ期的MSI-H結(jié)直腸ai患者對比MSS患者均具有***的生存優(yōu)勢開始，此后人們進(jìn)行了一系列MS狀態(tài)與結(jié)腸ai預(yù)后的相關(guān)研究，多數(shù)研究結(jié)果提示MSI對結(jié)腸ai的預(yù)后作用與臨床分期密切相關(guān)。在II期結(jié)腸ai中，MSI-H/dMMR是預(yù)后良好的標(biāo)志已被絕大多數(shù)研究所證實(shí)，基本達(dá)成共識；而對于III期結(jié)腸ai的預(yù)后價(jià)值尚存在爭議；對于IV期結(jié)腸ai，由于MSI-H例數(shù)過少，因此相關(guān)結(jié)果不能說明其是否具有預(yù)后價(jià)值。MS狀態(tài)對結(jié)腸ai的預(yù)后作用，不*與臨床分期相關(guān)，還與**原發(fā)部位相關(guān)。N0147研究結(jié)果顯示在III期結(jié)腸ai中，近端結(jié)腸（盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸）。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)利用數(shù)字PCR進(jìn)行低豐度突變研究等；提供循環(huán)腫l瘤DNA檢測，可檢測EGFR、ERBB2等Biomarker。安徽定制dMMR抗體檢測試劑鄭重承諾

    免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白(keratin)顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2、敏感性高在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍;現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。3、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。天津定制dMMR抗體檢測試劑共同合作邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)可以提供覆蓋肺ai、腸ai、肝ai、胃ai、乳腺ai、前列腺ai等多種實(shí)體瘤的上百項(xiàng)檢測項(xiàng)目。

    每孔加50μl含％abts(southernbiotech公司)和％h2o2的檸檬酸緩沖液()進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測定405nm波長下的od值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為igg2b型鼠源單克隆抗體。二、親和常數(shù)測定包被msh6重組蛋白，包被濃度為2μg/ml,100μl/孔，4℃包被過夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封閉液37℃封閉2h，pbs-t洗3次。實(shí)施例4中純化的單克隆抗體，從1：200開始2倍梯度稀釋，***1孔留空白對照，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp標(biāo)記的羊抗鼠二抗1：20000稀釋，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl含％tmb(sigma公司)和％h2o2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色10min，加50μ。用酶標(biāo)儀測定波長450nm的吸光值。畫出od值對應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲線，找出≥1/2“平臺od值”對應(yīng)的稀釋倍數(shù)a。利用下列公式計(jì)算出親和常數(shù)為×109。三、單抗反應(yīng)特異性和應(yīng)用效果選擇msh6重組蛋白，用免疫印跡的方法檢測本發(fā)明單克隆抗體的識別特異性，免疫印跡實(shí)驗(yàn)過程如下：每種蛋白上樣約5-10ng，進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在bio-rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到pvdf膜上(millipore公司)。將膜置于含5％脫脂奶粉的tbs-t封閉液中4℃過夜。加入單克隆抗體msh6。

    錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）在IHC檢測應(yīng)用中的由來【一】認(rèn)識錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）在IHC檢測應(yīng)用中的由來【二】錯(cuò)配修復(fù)缺失三、微衛(wèi)星不穩(wěn)定的檢測MSI屬于一種基因水平的變異現(xiàn)象，而背后的根源則是錯(cuò)配修復(fù)蛋白功能缺失。故無論從蛋白水平檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等分子，還是在基因水平檢測MSI狀態(tài)均有助于判斷該類病因?，F(xiàn)已證明二者的符合性達(dá)到。然而由于人們首先在結(jié)直腸ai中認(rèn)識了微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象，并且將結(jié)直腸ai被分為MSI-H（MSI高度不穩(wěn)定）型和MSS（微衛(wèi)星穩(wěn)定型）以區(qū)別其在預(yù)后與***方面的差異。早期的檢測方法為通過對Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測，根據(jù)其存在MSI的數(shù)量將結(jié)直腸ai分為MSI-H（具有兩個(gè)和兩個(gè)以上的位點(diǎn)改變）、MSI-L（只有一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變）和微衛(wèi)星穩(wěn)定型(MSS)。MSI-L型在臨床表現(xiàn)上與MSS**無明顯差別，通常被歸為MSS**。隨后當(dāng)人們認(rèn)識到為星星不穩(wěn)定現(xiàn)象源于錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能缺陷，并且對其機(jī)制研究透徹之后逐漸形成通過對錯(cuò)配修復(fù)蛋白的檢測來確定MSI的方法，即錯(cuò)配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)檢測。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具體包括全套的Leica組織樣本制備系統(tǒng)，Ventana、Leica、DAKO等全自動(dòng)免疫組化儀。

    發(fā)明人還提供上述任一所述的抗msh6蛋白單克隆抗體，在msh6蛋白免疫檢測中的用途。進(jìn)一步地，所述免疫檢測包括免疫組織化學(xué)法，免疫印跡法和酶聯(lián)免疫法。區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，上述技術(shù)方案依據(jù)msh6蛋白、抗原性、組成氨基酸的親疏水性以及二級結(jié)構(gòu)，選擇msh6蛋白第1-100位氨基酸序列與gst蛋白融合表達(dá),其dna編碼序列為seqid**,用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，得到免疫原。對小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和亞克隆，獲得高效分泌抗msh6蛋白單克隆抗體的單克隆細(xì)胞系abm58060-20a2-pu,以及由該細(xì)胞系所分泌的抗msh6蛋白單克隆抗體。本方案得到的抗體具有高特異性、敏感性，可以特異性識別表達(dá)msh6蛋白的細(xì)胞，適用于免疫學(xué)檢測，特別是免疫組化檢測?；旧Y(jié)果圖(左為abm58060-20a2-pu分泌的msh6，右為市售msh6)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1重組msh6蛋白片段的制備一、抗原片段選擇依據(jù)uniprot中登錄號為p52701的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列和二級結(jié)構(gòu)分析，全長為1360個(gè)氨基酸長度的msh6蛋白含有muts超家族區(qū)域，其分子量約為152kda左右，依據(jù)通過在線服務(wù)器測的蛋白的二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)和表面可及性(surfaceaccessibility)參數(shù)，并通過對其抗原性指數(shù)(jamesonba,:(1):181-6.)的分析結(jié)果。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)--伴隨診斷整體解決方案提供者,檢測技術(shù)平臺全涵蓋.陜西專注dMMR抗體檢測試劑值得推薦

PMS2抗體試劑 蘇蘇械備20180570號.安徽定制dMMR抗體檢測試劑鄭重承諾

    atccnumbercrl-8287)以5:1比例混合，離心1500rpm，5min。棄上清后離心管放入37℃水浴中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的peg1500(roche公司)，并攪動(dòng)細(xì)胞。在溫水中靜置1min后，加入10ml無血清的imdm(sigma公司)，混勻，離心1000rpm，5min。棄上清后，加入10ml血清(paa公司)小心的將細(xì)胞吹打起來，并加入5ml混合10xhat(sigma公司)的胸腺細(xì)胞，混勻。再加入25ml含有％硝基纖維素(sigma公司)的半固體培養(yǎng)基充分混勻，然后均勻的倒入20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三、克隆化及elisa篩選陽性雜交瘤細(xì)胞：融合后11天，克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中，在解剖鏡下，吸取圓、實(shí)、大的克隆團(tuán)(10板×93個(gè))打入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放入37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，細(xì)胞量大約占底面積2/3，取100μl上清進(jìn)行elisa篩選。陽性克隆完全換液，加入200μl含飼養(yǎng)細(xì)胞和1％ht(sigma公司)的完全培養(yǎng)基。兩天后進(jìn)行第二次elisa篩選，陽性克隆轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和ht)的24孔板培養(yǎng)。五天后取100μl上清進(jìn)行第三次elisa篩選，陽性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。安徽定制dMMR抗體檢測試劑鄭重承諾