免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟: 1. 樣本準(zhǔn)備 2. 細(xì)胞裂解:使用裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解)裂解細(xì)胞,釋放蛋白質(zhì)。 3. 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定:使用BCA、Bradford或Lowry等方法測(cè)定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。 4. 抗體預(yù)處理:如果使用預(yù)固定的抗體,需先將抗體固定在固相支持物上,如瓊脂糖珠或磁性微珠。 5. 免疫沉淀反應(yīng):將裂解液與特異性抗體(固定或未固定)混合,并在4°C下緩慢搖晃孵育過(guò)夜,以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。 6. 固相支持物的回收:對(duì)于未固定的抗體,加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。...
免疫沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。 瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。 與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。 簡(jiǎn)而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡(jiǎn)稱IP)是一種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離和純化特定蛋白質(zhì)。這項(xiàng)技術(shù)依賴于抗體的高度特異性,通過(guò)抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的富集和純化。 具體操作步驟通常包括以下幾個(gè)階段:裂解細(xì)胞或組織,抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合,固相支持物的使用,免疫復(fù)合物的捕獲,洗滌,洗脫分析。 免疫沉淀技術(shù)不僅可以用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在和量,還可以用于研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)的功能等。此外,免疫沉淀技術(shù)是許多其他高級(jí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ),如染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(ChIP-Seq)和蛋白質(zhì)相互作...
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)不同于WB實(shí)驗(yàn)的樣品制備,對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品制備要求更高,除了要控制所有操作盡量在冰上完成外,關(guān)鍵的是裂解液的成分,裂解液成分直接決定了樣品質(zhì)量。 主要影響: 1. 蛋白的釋放:許多目的蛋白定位在細(xì)胞器,質(zhì)膜,細(xì)胞核,細(xì)胞骨架中,但通常這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很難被裂解液有效溶解,所以很難將這些蛋白釋放出來(lái)。 2. 蛋白相互作用:不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)間相互作用影響程度不同,一些互作較弱的蛋白對(duì)盡管在比較溫和的裂解液配方中仍然會(huì)被破壞。 免疫沉淀技術(shù)Co-IP是什么?深圳ChIP免疫沉淀磁珠哪個(gè)公司好用 Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,其應(yīng)...
免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法??贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的珠子(agarose或Sepharose)孵育,通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。免疫沉淀是一種生物學(xué)技術(shù),它利用抗體的特異性結(jié)合特性來(lái)富集和分離混合物中的特定蛋白質(zhì)。這種技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)功能的強(qiáng)大工具。免疫沉淀技術(shù)RIP的...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡(jiǎn)稱IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測(cè)是否存在目的蛋白。 免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測(cè)或其他檢測(cè)技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測(cè)方法檢測(cè)...
ChIP實(shí)驗(yàn)的基本步驟包括: 1. 交聯(lián)(Crosslinking):細(xì)胞被甲醛等交聯(lián)劑處理,使得蛋白質(zhì)和DNA之間的相互作用被固定,形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。 2. 細(xì)胞裂解:裂解細(xì)胞,釋放染色質(zhì),同時(shí)保持蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的完整性。 3. 超聲或酶解:通過(guò)超聲或酶解將染色質(zhì)切割成較小的片段,以便于后續(xù)步驟中的免疫沉淀。 4. 免疫沉淀(Immunoprecipitation):加入針對(duì)特定組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子的抗體,這些抗體會(huì)特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)上。 5. 捕獲復(fù)合物:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子捕獲抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。 6. 洗...
ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述: 1. 目標(biāo)蛋白的選擇:確定您想要研究的目標(biāo)蛋白,例如特定的轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾。 2. 樣本的準(zhǔn)備:根據(jù)研究的需要選擇合適的細(xì)胞或組織樣本。 3. 抗體的選擇:選擇具有高特異性和親和力的抗體,這對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。 4. 交聯(lián):使用甲醛等交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)與DNA在體內(nèi)共價(jià)結(jié)合,形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。 5. 細(xì)胞裂解:裂解細(xì)胞以釋放染色質(zhì),同時(shí)保持蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的完整性。 6. 染色質(zhì)的剪切:通過(guò)超聲或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟: 1. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇: 2. 抗體的選擇:選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體來(lái)捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì) 3. 樣本的準(zhǔn)備:收集和準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放:選擇合適的裂解條件,如pH值、離子強(qiáng)度、去污劑等。 5. 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度,以便于后續(xù)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。 6. 免疫沉淀的操作:將特異性抗體與裂解液混合,并在適宜的條件下孵育,以形成抗體-抗原復(fù)合物。 7. 非特異性結(jié)合的減少:通過(guò)預(yù)純化步驟去除可能的非特異性...
RIP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于: 1. 特異性:利用特異性抗體,可以精確地捕獲目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白及其相互作用的RNA。 2. 應(yīng)用場(chǎng)景多:適用于研究RNA結(jié)合蛋白、miRNA、lncRNA等非編碼RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。 3. 技術(shù)結(jié)合:RIP后的RNA可以用于多種下游分析,如qPCR、測(cè)序等,為研究RNA的功能和調(diào)控提供了重要信息。 RIP技術(shù)的限制包括: 1. 抗體質(zhì)量:需要高質(zhì)量的特異性抗體,否則可能得到假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。 2. 非特異性結(jié)合:可能存在非特異性結(jié)合問(wèn)題,需要仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)照來(lái)控制。 免疫沉淀Co-IP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?上海免疫沉...
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。 1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。 2. 親和力:抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過(guò)程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。 3. 抗體類型:?jiǎn)慰寺】贵w提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。 4. 應(yīng)用驗(yàn)證:選擇已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體,這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。 5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評(píng)價(jià),以幫助做出決策。 免疫沉淀...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 基本原理 免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)(抗原)之間的特異性相互作用。通過(guò)使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體,可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。 免疫沉淀技術(shù)有多種類型,包括: 1. 個(gè)別免疫沉淀法(Individual IP) 2. 免疫共沉淀法(Co-IP) 3. 染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP) 4. RNA免疫沉淀法(RIP) 近年來(lái),免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡(jiǎn)稱IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測(cè)是否存在目的蛋白。 免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測(cè)或其他檢測(cè)技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測(cè)方法檢測(cè)...
Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,其應(yīng)用場(chǎng)景如下: 1. 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的鑒定:Co-IP可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的結(jié)合伙伴。 2. 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究:通過(guò)Co-IP技術(shù),科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)通路,如MAPK和PI3K/Akt通路等,為深入理解這些通路的功能和調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。 3. 藥物靶點(diǎn)篩選:利用Co-IP技術(shù),研究人員可以篩選潛在的藥物靶點(diǎn)。 疾病機(jī)制研究:通過(guò)分析疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用,Co-IP有助于揭示疾病的分子機(jī)制。 4. 抗體藥物開(kāi)發(fā):Co-IP可用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)...
RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要考慮多個(gè)方面,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。 1. 目標(biāo)蛋白的選擇:確定你想要研究的目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白(RBP)。 2. 陽(yáng)性和陰性對(duì)照:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),需要包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。 3. 細(xì)胞培養(yǎng)與裂解:選擇合適的細(xì)胞類型進(jìn)行培養(yǎng)。 4. 抗體孵育:將特異性抗體與細(xì)胞裂解液孵育,以形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。 5. 免疫沉淀:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子進(jìn)行免疫沉淀,捕獲抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。 6. 洗滌和分離:洗滌...
ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法概述: 1. 交聯(lián):將細(xì)胞與交聯(lián)劑(如1%甲醛)孵育,通常在室溫下進(jìn)行10-15分鐘。 2. 終止交聯(lián):添加甘氨酸以終止交聯(lián)反應(yīng),孵育5分鐘。 3. 收集細(xì)胞:通過(guò)離心收集細(xì)胞,并用PBS洗滌以去除交聯(lián)劑。 4. 細(xì)胞裂解:使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞,釋放染色質(zhì)。 5. 染色質(zhì)剪切:使用超聲波或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小的片段。 6. 免疫沉淀:將剪切后的染色質(zhì)與特異性抗體孵育,然后添加蛋白A/G磁珠。 7. 洗滌:用低鹽、高鹽和LiCl洗滌液洗滌磁...
ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)大的技術(shù),用于研究蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用,尤其是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、復(fù)制以及表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。然而,像所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)一樣,ChIP實(shí)驗(yàn)也有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 ChIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn): 1. 體內(nèi)反應(yīng)的反映:ChIP提供了一種在體內(nèi)研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的方法,能夠真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白的調(diào)控信息。 2. 全基因組覆蓋:ChIP技術(shù)可以覆蓋整個(gè)基因組,提供關(guān)于蛋白質(zhì)-DNA相互作用的視圖。 3. 適用于多種蛋白質(zhì):ChIP可以用來(lái)研究組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子以及其他DNA結(jié)合蛋白。 ChIP實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn): ...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟: 1. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇: 2. 抗體的選擇:選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體來(lái)捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì) 3. 樣本的準(zhǔn)備:收集和準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放:選擇合適的裂解條件,如pH值、離子強(qiáng)度、去污劑等。 5. 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度,以便于后續(xù)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。 6. 免疫沉淀的操作:將特異性抗體與裂解液混合,并在適宜的條件下孵育,以形成抗體-抗原復(fù)合物。 7. 非特異性結(jié)合的減少:通過(guò)預(yù)純化步驟去除可能的非特異性...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)在生物醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用,以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域: 1. 蛋白質(zhì)相互作用研究:IP技術(shù)可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,揭示蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。 2. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究:通過(guò)IP技術(shù),可以富集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制和調(diào)控[。 3. 蛋白質(zhì)修飾研究:IP技術(shù)可以用于富集經(jīng)過(guò)特定修飾的蛋白質(zhì),例如磷酸化、乙酰化等,進(jìn)而研究蛋白質(zhì)修飾的功能和調(diào)控。 4. 藥物靶點(diǎn)篩選:IP技術(shù)可以用于富集藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì),幫助篩選潛在的藥物靶點(diǎn)。 5. 疾病機(jī)制研究:通...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)步驟通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié): 1. 細(xì)胞裂解:首先需要收集細(xì)胞并裂解它們,以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。這通常通過(guò)添加含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液來(lái)完成,以防止蛋白質(zhì)降解。 2. 裂解物上清:裂解后的細(xì)胞混合物通常需要通過(guò)離心來(lái)去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,從而獲得上清。 3. 抗體的添加:將特定于目標(biāo)蛋白的抗體加入到裂解物中。這些抗體將特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。 4. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物。 5. 免疫復(fù)合物的捕獲:使用Protein A/G結(jié)合的磁珠來(lái)捕獲免疫...
RIP 技術(shù)的原理(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀)主要是運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái),經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測(cè)序分析。 RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用,但由于研究對(duì)象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物,RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同,如:RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶,抗體需經(jīng)...
免疫沉淀(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來(lái),初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一種在體外探測(cè)兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理非常簡(jiǎn)單,如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話,那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),另一個(gè)蛋白也會(huì)被同時(shí)沉淀下來(lái)。與酵母雙雜交技術(shù)不同,免疫共沉淀技術(shù)所利用的是抗原和抗體間的免疫反應(yīng),是一種基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的方法。 免疫沉淀技術(shù)IP的應(yīng)用有哪些?蘇州ChIP免...
免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法??贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的珠子(agarose或Sepharose)孵育,通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。免疫沉淀是一種生物學(xué)技術(shù),它利用抗體的特異性結(jié)合特性來(lái)富集和分離混合物中的特定蛋白質(zhì)。這種技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)功能的強(qiáng)大工具。免疫沉淀Co-IP技...
免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)是一種用于研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。RIP技術(shù)可以幫助我們了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,并發(fā)現(xiàn)miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。 RIP技術(shù)的原理是利用針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白的抗體,將細(xì)胞內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來(lái)。然后,可以通過(guò)分離純化,對(duì)這些復(fù)合物中的RNA進(jìn)行檢測(cè),如qPCR驗(yàn)證或測(cè)序分析。 表觀遺傳學(xué)和RNA生物學(xué)領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注增加。RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對(duì)RNA潛能的這一新認(rèn)識(shí)帶動(dòng)了新方法的發(fā)展,使研究人員能...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟: 1. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇: 2. 抗體的選擇:選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體來(lái)捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì) 3. 樣本的準(zhǔn)備:收集和準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放:選擇合適的裂解條件,如pH值、離子強(qiáng)度、去污劑等。 5. 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度,以便于后續(xù)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。 6. 免疫沉淀的操作:將特異性抗體與裂解液混合,并在適宜的條件下孵育,以形成抗體-抗原復(fù)合物。 7. 非特異性結(jié)合的減少:通過(guò)預(yù)純化步驟去除可能的非特異性...
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)不同于WB實(shí)驗(yàn)的樣品制備,對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品制備要求更高,除了要控制所有操作盡量在冰上完成外,關(guān)鍵的是裂解液的成分,裂解液成分直接決定了樣品質(zhì)量。 主要影響: 1. 蛋白的釋放:許多目的蛋白定位在細(xì)胞器,質(zhì)膜,細(xì)胞核,細(xì)胞骨架中,但通常這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很難被裂解液有效溶解,所以很難將這些蛋白釋放出來(lái)。 2. 蛋白相互作用:不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)間相互作用影響程度不同,一些互作較弱的蛋白對(duì)盡管在比較溫和的裂解液配方中仍然會(huì)被破壞。 免疫沉淀Co-IP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?蘇州anti Flag免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨 免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭?..
RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括: 1. 細(xì)胞收集與交聯(lián):培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑(如甲醛)進(jìn)行交聯(lián),以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。 2. 細(xì)胞裂解:收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解,釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過(guò)程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。 3. 超聲處理:使用超聲波破壞細(xì)胞,獲得更小的染色質(zhì)片段,這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。 4. 除去細(xì)胞碎片:通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。 5. 免疫沉淀:將針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白(RBP)的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間,使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。 6. 捕獲免疫復(fù)合物:添...
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)在生物醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用,以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域: 1. 蛋白質(zhì)相互作用研究:IP技術(shù)可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,揭示蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成和蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。 2. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究:通過(guò)IP技術(shù),可以富集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制和調(diào)控[。 3. 蛋白質(zhì)修飾研究:IP技術(shù)可以用于富集經(jīng)過(guò)特定修飾的蛋白質(zhì),例如磷酸化、乙酰化等,進(jìn)而研究蛋白質(zhì)修飾的功能和調(diào)控。 4. 藥物靶點(diǎn)篩選:IP技術(shù)可以用于富集藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì),幫助篩選潛在的藥物靶點(diǎn)。 5. 疾病機(jī)制研究:通...
免疫沉淀IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。 瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。 與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。 簡(jiǎn)而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)...
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)不同于WB實(shí)驗(yàn)的樣品制備,對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品制備要求更高,除了要控制所有操作盡量在冰上完成外,關(guān)鍵的是裂解液的成分,裂解液成分直接決定了樣品質(zhì)量。 主要影響: 1. 蛋白的釋放:許多目的蛋白定位在細(xì)胞器,質(zhì)膜,細(xì)胞核,細(xì)胞骨架中,但通常這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很難被裂解液有效溶解,所以很難將這些蛋白釋放出來(lái)。 2. 蛋白相互作用:不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)間相互作用影響程度不同,一些互作較弱的蛋白對(duì)盡管在比較溫和的裂解液配方中仍然會(huì)被破壞。 免疫沉淀技術(shù)IP的應(yīng)用有哪些?溫州anti DYKDDDDK免疫沉淀磁珠應(yīng)用 免疫沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭贵w...