免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡稱IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的實(shí)驗(yàn)方法。南京Co IP免疫沉淀技術(shù)服務(wù)
真核生物的基因組 DNA 以染色質(zhì)(Chromatin)的形式存在。因此,研究蛋白質(zhì)與 DNA 在染色質(zhì)環(huán)境中的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑,而染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)技術(shù)是目前公認(rèn)的研究此相互作用的選擇,是真核生物基因表達(dá)機(jī)制研究中不可或缺的技術(shù)之一。
它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下,固定蛋白質(zhì)-DNA(染色質(zhì))復(fù)合物,并將其切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法(抗體親和)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA,通過對(duì)目的片段的純化與后期檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。
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免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型:單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證:選擇已經(jīng)過免疫沉淀(IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗(yàn)證的抗體,這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評(píng)價(jià),以幫助做出決策。
RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括:
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián):培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑(如甲醛)進(jìn)行交聯(lián),以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解:收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解,釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理:使用超聲波破壞細(xì)胞,獲得更小的染色質(zhì)片段,這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片:通過離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。
5. 免疫沉淀:將針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白(RBP)的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間,使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復(fù)合物:添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌:多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián):使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián),釋放RNA。
9. RNA提取與純化:從免疫沉淀樣品中提取RNA,并進(jìn)行純化。
10. RNA分析:使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA,以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類。
免疫沉淀Co-IP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?
ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法概述:
1. 交聯(lián):將細(xì)胞與交聯(lián)劑(如1%甲醛)孵育,通常在室溫下進(jìn)行10-15分鐘。
2. 終止交聯(lián):添加甘氨酸以終止交聯(lián)反應(yīng),孵育5分鐘。
3. 收集細(xì)胞:通過離心收集細(xì)胞,并用PBS洗滌以去除交聯(lián)劑。
4. 細(xì)胞裂解:使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞,釋放染色質(zhì)。
5. 染色質(zhì)剪切:使用超聲波或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小的片段。
6. 免疫沉淀:將剪切后的染色質(zhì)與特異性抗體孵育,然后添加蛋白A/G磁珠。
7. 洗滌:用低鹽、高鹽和LiCl洗滌液洗滌磁珠,去除非特異性結(jié)合物。
8. 洗脫:用洗脫緩沖液洗脫DNA。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián):用蛋白酶K處理,然后在65°C下加熱過夜以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。
10. DNA純化:使用商業(yè)試劑盒或標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿方法純化DNA。
11. 分析:使用qPCR分析富集的DNA,或進(jìn)行測序以確定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
免疫沉淀技術(shù)ChIP是什么?南京RIP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠
免疫沉淀技術(shù)ChIP實(shí)驗(yàn)步驟。南京Co IP免疫沉淀技術(shù)服務(wù)
免疫沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢。
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