引物用于啟始PCR反應,其質(zhì)量直接關乎實驗成敗。引物設計一般遵循以下原則:長度在15~30bp(一般為18~25bp),GC含量盡可能在50%~60%。嚴重的比例失衡會導致引物二聚體增多。Tm值在50℃~65℃。過高會導致擴增受影響(DNA聚合酶有...
—20℃)凍存——應選較佳稀度凍存。③若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍,而后分裝10μl/瓶→凍存(-20℃)于冰箱備用。④關于Ab保存應參照說明書。(3)Ab濃度的選擇Ab濃度不可太高或太低,因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內(nèi)進行,若一...
如肽類、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學方法顯示,因而目前在基礎與臨床科研中被廣泛應用。較近幾年,分子生物學研究異常活躍,但較終還要歸到形態(tài)上來。用免疫組織化學方法對所研究的大分子分子進行定位,進而深入研究其功能。免疫組化技術免...
免疫組織化學(Immunohistochemistry)又稱 免疫細胞化學。它是 組織化學的分支,它是用標記的 特異性抗體(或抗原)對組織內(nèi)抗原(或抗體)的分布進行組織和細胞原位檢測技術。 中文名 免疫組化技術 外文名 Immunohistochemis...
因此大量有關qPCR發(fā)表的文獻中存在結果證據(jù)不足甚至是相互矛盾的結果,這對科學研究是一個很大的危險??茖W文獻的發(fā)表和撤回也為人們提出了警示。多數(shù)研究報告缺少足夠的信息加劇了這個問題,使用qPCR的文獻沒有提供足夠的實驗細節(jié),可以讓讀者評估結果的質(zhì)量或者重復實驗...
Bio-Rad 的 qPCR 設備全系標配 8 個溫度梯度功能,只要運行一次實驗,就能找到較合適的退火溫度條件。專門的蜂巢式反應模塊,保證了很好的溫度均一性,即使在較快的升降溫過程中同樣如此。優(yōu)化溫度梯度實驗中,你只需要配好 8 個組分完全相同的反應體系(模板...
Ct 會受到閾值的影響,每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同,進而影響閾值和 Ct 值。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關系,起始模板量濃度越高,Ct值越小;起始模板量濃度越低,Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入...
除了RT-qPCR實驗上面所提到的非反轉錄控制外,所有qPCR反應還需要更多的控制和/或量化標準。在SYBRGreenI反應中應當用探針區(qū)別預期PCR產(chǎn)物中區(qū)別不可預知的擴增產(chǎn)物(如引物二聚體)時,應用NTCs檢測PCR污染。NTCs應當包含在每個板或者批樣品...
DAB顯色 背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時間,到出現(xiàn)特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗;DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色,這很可能說明你的抗體濃度過...
石蠟切片厚4~6μm,撈片于多聚賴氨酸防脫水劑中,60℃烘烤30min~60min,再脫蠟、脫水。這個處理過程的關鍵是要保證梯度二甲苯和酒精的濃度,使組織脫蠟、脫水干凈徹底,否則,水洗后切片含有“油珠”,呈云霧狀,沖洗不干凈,致使抗體在組織上分布不均,導致染色...
2000 年, M Manzano 等利用溫度梯度凝膠電泳的方法 分析 16S rRNA 對分離自食物中的利斯特氏菌進行了鑒定。 2001 年, HJ Monstein 等利用溫度梯度凝膠 電泳和 PCR 擴增 16S rRNA 的 V6 區(qū) ( 可變區(qū)) 片...
采用 16SrRNA基因克隆文庫的方法分析菌群組 成已應用于環(huán)境和臨床微生物中 , 它既可以 分析標本中細菌的種類, 又可以反映標本中各種細菌 的相對比例, 可以相對定量, 重要的是可通過這種方 式檢測到實驗室條件下不能培養(yǎng)的細菌, 所以在微生 物檢測方面具有...
qPCR是不是會做不好呢?即使是看了人家文獻里的PCR方法,照搬了人家的引物,還是做得每次結果都不一樣?其實具體原因有這么幾個。首先,你基本上不太會用移液頭。移液頭特別是微量移液頭,特別長期快速操作,也就是說彈簧沒來得及恢復又進行下一步按壓。極其容易導致……你...
定量PCR基因表達的實驗數(shù)據(jù)應該如何處理?總的來說,有三個層次的校正是必須要做的。參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX,這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除,使數(shù)據(jù)真正反映P...
擴增子是發(fā)生PCR反應的靶標基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標基因的數(shù)量,并不需要得到其全長序列,因此擴增子區(qū)段的選擇具有相當?shù)撵`活性,在基因讀碼框的內(nèi)部即可(mRNA的分析除外)。區(qū)段的選擇一般遵循以下原則:擴增子長度一般在75~200bp范圍。如果太長...
即使操作如此簡單,很多實驗者仍然會輕視。在此建議,將溫度梯度優(yōu)化納入到預實驗環(huán)節(jié)中,通過qPCR的溫度梯度方法確認比較好的Ta值。還要提醒大家,軟件預測的引物和探針的Ta值只用于參考,而且比較好Ta值會隨著反應環(huán)境的變化而變化,預測的準確度并沒有預期的那么高,...
相對來說比較難解決的,就是抑制物,在反轉錄過程中或者PCR過程中都可能有抑制物,這些抑制物,比如Na離子,EDTA,SDS,酚,血紅素,腐植酸等等,都會對qPCR結果產(chǎn)生影響。具體體現(xiàn)在擴增曲線里會是這樣:實際上去除抑制劑也只能在抽提的過程中盡量洗脫掉抑制劑,...
怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染?怎樣清理污染?一個辦法是運行背景校正反應板,當一個或多個反應孔連續(xù)顯示出不正常的高信號,則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下,執(zhí)行ROI的校正,當某個孔的信號明顯高出其他孔時,則...
擴增子測序是一種高靶向性地分析特定基因 組區(qū)域中基因變異的方法,是發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphisms,SNPs)的理想方 法。其利用 PCR 的引物來擴增基因組的特定區(qū)域, 靶向地捕...
rRNA 鑒定微生物具有高靈敏度和特異性,且 所需檢測時間短,不依賴于微生物的分離培養(yǎng),所以可用于臨 床上快速、準確鑒定致病微生物,并且可以檢測出未知的新型 微生物種類。16SrRNA 由于高度保守及變異性較小,適 合 于 屬內(nèi)種間...
怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染?怎樣清理污染?一個辦法是運行背景校正反應板,當一個或多個反應孔連續(xù)顯示出不正常的高信號,則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下,執(zhí)行ROI的校正,當某個孔的信號明顯高出其他孔時,則...
16S~23SrRNA 基因間區(qū)結構特點及序列分析的基本 原理 16S~23SrRNA 區(qū) 間ISR 是 位 于 16SrRNA 基 因 與 23SrRNA 基因之間的 區(qū) 間 序 列,不僅序列長度存在差異,而 且序列中間有tRNA 的插...
rRNA 結構既具保守性又具高變性。保守性反映生物物種的親緣關系, 高變性則揭示生物物種的特征核酸序列, 是屬種鑒定的分子基礎。 16S rRNA 基因大小適中, 約 1.5Kb 左右, 含有高 度保守的基因片段, 同時在不同的菌株間也含有 變異的核酸片段。因...
規(guī)范化是一個可知的qPCR檢測重要的組成部分,因為這個過程控制提取的變化,反轉錄的量,擴增效率,從而可以通過不同樣本比較mRNA濃度。使用參考基因作為內(nèi)部控制是**常用規(guī)范化細胞mRNA數(shù)據(jù)的方法,但是雖然使用參考基因被大多數(shù)適當規(guī)范化策略所接受,但是它們的用...
擴增子是發(fā)生PCR反應的靶標基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標基因的數(shù)量,并不需要得到其全長序列,因此擴增子區(qū)段的選擇具有相當?shù)撵`活性,在基因讀碼框的內(nèi)部即可(mRNA的分析除外)。區(qū)段的選擇一般遵循以下原則:擴增子長度一般在75~200bp范圍。如果太長...
真核生物80S核糖體中包含4種沉降系數(shù)不同的rRNA,其中,40S核糖體亞基(小亞基)中包含18S rRNA,而60S核糖體亞基(大亞基)中包含5S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。即真核細胞核糖體中通常含28S、18S、5.8S和5S 四種r...
常用染色方法 根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法,免疫酶標法,親和組織化學法,后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位,其中生物素—抗生物素染色法較好常用。判定分析編...
分類 1)按標記物質(zhì)的種類,如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等,可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。 2)按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步、三步或多步法)。與...
芯片與常規(guī)切片免疫組化標記的比較 常規(guī)制片免疫組化陰性,而組織芯片免疫組化陽性者包括ER2例,PR1例;常規(guī)制片免疫組化陽性,而組織芯片免疫組化陰性者包括nm23、Her-2各1例。而部分病例常規(guī)制片免疫組化和組織芯片免疫組化陽性表達強度略有不同。組織芯片的免...
封片 為了長期保存,我們一般用中性樹膠等封片,避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐...