定量PCR基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次的校正是必須要做的。參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以相互比較。計(jì)算相對(duì)于基準(zhǔn)樣品（Calibrator）的相對(duì)基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時(shí)和6小時(shí)的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計(jì)算處理/未處理、6小時(shí)/0小時(shí)、患病/正常。qPCR的好處您知道么？青海TaqMan熒光探針qPCR公司
數(shù)據(jù)分析包括原始數(shù)據(jù)檢查，其質(zhì)量和可靠性評(píng)估，以及可值得報(bào)告結(jié)果的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)采集和提交的變異策略已描述過(guò)了，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)顯示qPCR的數(shù)據(jù)分析方法不同于其性能。數(shù)據(jù)分析方法和可信度估計(jì)的詳細(xì)信息是必須的，同時(shí)所使用的軟件說(shuō)明書。確定殿堂值和如何處理這些數(shù)據(jù)的方法必須指出。記錄實(shí)驗(yàn)精度需要確認(rèn)用于評(píng)價(jià)變異的統(tǒng)計(jì)方法(如95%CIs)和相應(yīng)的濃度或Cq值的出現(xiàn)。這些信息應(yīng)包括重復(fù)性和再現(xiàn)性數(shù)據(jù)，如果可用。如上所述，報(bào)告CVs為Cqs是不恰當(dāng)?shù)?，因?yàn)镃qs常低于(因此可能誤導(dǎo))CVs計(jì)算的拷貝數(shù)量值。信息必須提供用于評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性的方法，包括組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。安徽SYBRGreen法qPCR公司電話上海融享生物科技有限公司TaqMan熒光探針qPCR服務(wù)。
Bio-Rad 的 qPCR 設(shè)備全系標(biāo)配 8 個(gè)溫度梯度功能，只要運(yùn)行一次實(shí)驗(yàn)，就能找到較合適的退火溫度條件。專門的蜂巢式反應(yīng)模塊，保證了很好的溫度均一性，即使在較快的升降溫過(guò)程中同樣如此。優(yōu)化溫度梯度實(shí)驗(yàn)中，你只需要配好 8 個(gè)組分完全相同的反應(yīng)體系（模板量適中即可）。在然后的結(jié)果中，能到得到較小 Cq 值的溫度點(diǎn)即為比較好退火溫度。通常，比較好的退火溫度是狹窄的一個(gè)范圍，而不是單一的溫度點(diǎn)，比如 57℃～58℃ 即為比較好的退火溫度。對(duì)于染料法的 qPCR 體系，還要通過(guò)熔解曲線分析檢查各退火溫度下產(chǎn)物的特異性情況，優(yōu)先沒有非特異性擴(kuò)增，且 Cq 值較小的退火溫度為較適退火溫度。
以下信息qPCR試驗(yàn)必須提供的：數(shù)據(jù)庫(kù)登陸每個(gè)靶基因和參考基因的數(shù)目，每個(gè)引物和任何探針的外顯子位點(diǎn)，每個(gè)寡核苷酸的濃度和序列，包括性質(zhì)、位點(diǎn)和結(jié)合任何染料和/或修飾堿基。同樣需要聚合酶的名稱和濃度，每個(gè)反應(yīng)的模板(DNA或RNA)數(shù)量，Mg2+濃度，緩沖液中確切化學(xué)組成(鹽、PH值、添加劑)，以及反應(yīng)量。研究人員還必須確認(rèn)他們所使用的儀器，所有PCR循環(huán)條件的文件。因?yàn)樗褂玫暮牟挠绊憻嵫h(huán)，必須確定使用單一試管、帶或者板，以及它們的制造商。所使用的塑料制品的透明度，如白色或者透明，這也重要，因?yàn)椴煌乃芰系臒晒夥瓷涿舾行圆煌?。?dāng)使用板時(shí)，密封(熱粘合或粘合劑)的方法可以影響板周邊樣品的蒸發(fā)，這也要記錄。因?yàn)镻CR效能高度依賴于所使用的引物，因此引物的序列必須發(fā)表。這個(gè)要求是完全可行的，甚至是商業(yè)性的引物，因?yàn)橛邢壤Ａ硗鈴?qiáng)烈建議提交給公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如RTprimerDB，這些數(shù)據(jù)庫(kù)可以成為通用的交換所。上海融享生物科技有限公司專業(yè)的qPCR。
什么是CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？CT值與起始DNA濃度的對(duì)數(shù)成反比：如果：不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同。這些PCR的反應(yīng)效率接近100%?？梢詮纳厦娴墓酵瞥鱿鄬?duì)含量（X01/X02）=2-ΔCT。假設(shè)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時(shí)IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對(duì)照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的測(cè)定結(jié)果都是CT值，而沒有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總RNA的pg數(shù)。內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法哪種數(shù)據(jù)更精密？是同樣可靠的。內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的反應(yīng)條件較接近一致，缺點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針相互之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制，導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。外標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)在于目標(biāo)基因與管家基因的引物和探針之間沒有發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)與抑制的機(jī)會(huì)，但是不同管之間的反應(yīng)條件差異比同管的要大，也會(huì)導(dǎo)致它們的PCR效率有差異。兩相比較，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的數(shù)據(jù)精確度是一樣的。上海SYBR熒光染料qPCR機(jī)構(gòu)哪家好？安徽SYBRGreen法qPCR公司電話
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規(guī)范化是一個(gè)可知的qPCR檢測(cè)重要的組成部分，因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程控制提取的變化，反轉(zhuǎn)錄的量，擴(kuò)增效率，從而可以通過(guò)不同樣本比較mRNA濃度。使用參考基因作為內(nèi)部控制是**常用規(guī)范化細(xì)胞mRNA數(shù)據(jù)的方法，但是雖然使用參考基因被大多數(shù)適當(dāng)規(guī)范化策略所接受，但是它們的用途必須為特定的組織或者細(xì)胞和特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效。不幸的是雖然大家越來(lái)越意識(shí)到系統(tǒng)性確認(rèn)的重要性，大家也知道使用不恰當(dāng)?shù)膮⒖蓟蜃鳛橐?guī)范有潛在的高度誤導(dǎo)性，但是很多人還是一直忽視這些因素。因此很多分子分析仍然包含沒有規(guī)范化的qPCR數(shù)據(jù)。規(guī)范化涉及到報(bào)告研究基因和參考基因RNA濃度的比率。參考基因的mRNA應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定表達(dá)，它們的豐度應(yīng)當(dāng)和樣本中mRNA總量強(qiáng)相關(guān)。規(guī)范化反對(duì)使用一個(gè)參考基因，除非研究人員有明確的給審稿人提供明確的證據(jù)，證實(shí)其在實(shí)驗(yàn)條件下保持不變。參考基因比較好數(shù)量和選擇必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定和報(bào)告的方法來(lái)證實(shí)。青海TaqMan熒光探針qPCR公司