完整的探針包括熒光基團(tuán)、淬滅基團(tuán)和寡核苷酸序列三部分，理想的探針應(yīng)該具有特異性高、熒光本底低等特點(diǎn)。對(duì)于寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)一般遵循以下原則：GC含量30%～80%，C堿基要多于G堿基，長(zhǎng)度一般15～30bp。過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響淬滅效率，導(dǎo)致熒光本底較高；過(guò)短則導(dǎo)致特異性下降。Tm值一般比引物的要高5～10℃。5’端不能安置G堿基。G堿基本身具有熒光淬滅的特性，會(huì)導(dǎo)致熒光基團(tuán)被切掉后也無(wú)法發(fā)出熒光。熒光基團(tuán)根據(jù)檢測(cè)的多重性靈活選擇，一般優(yōu)先常規(guī)的 FAM 和 HEX，同時(shí)針對(duì)不同的熒光基團(tuán)選擇合適的淬滅基團(tuán)。qPCR數(shù)據(jù)分析請(qǐng)找上海融享生物科技有限公司。重慶實(shí)時(shí)熒光定量qPCR實(shí)驗(yàn)qPCR是不是會(huì)做不好...

負(fù)對(duì)照有信號(hào)引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。擴(kuò)增效率低反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋?zhuān)偌尤敕磻?yīng)體系中，減少抑制物的影響。上海SYBR熒光染料qPCR機(jī)構(gòu)哪家靠譜？廣西SYBRGreen法qPCR公司分析敏感性(Analytica...

引物用于啟始PCR反應(yīng)，其質(zhì)量直接關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗。引物設(shè)計(jì)一般遵循以下原則：長(zhǎng)度在15～30bp（一般為18～25bp），GC含量盡可能在50%～60%。嚴(yán)重的比例失衡會(huì)導(dǎo)致引物二聚體增多。Tm值在50℃～65℃。過(guò)高會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增受影響（DNA聚合酶有一定的工作溫度范圍）；過(guò)低容易產(chǎn)生錯(cuò)配，特異性差。目前很多軟件和網(wǎng)站可以預(yù)測(cè)引物的Tm值，要注意的是該值（包括引物合成單中的Tm）只只是預(yù)測(cè)，并不表示實(shí)際情況，PCR時(shí)比較好的退火溫度需要通過(guò)溫度梯度實(shí)驗(yàn)來(lái)得到。避免匹配模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。避免連續(xù)出現(xiàn)三個(gè)以上G或者C堿基。引物中堿基分布比較好是隨機(jī)的，否則可能會(huì)在基因組中的GC密集區(qū)發(fā)生...

試驗(yàn)結(jié)果：（1）比較低檢測(cè)限：40個(gè)循環(huán)和45個(gè)循環(huán)的比較低檢測(cè)限均為3copies/μL；（2）低濃度模板的陽(yáng)性檢出率：2，1，0.5copies/μL的陽(yáng)性檢出率完全相同，分別為90%，70%，60%；（3）平均值，SD，CV：將兩者平均值做配對(duì)T檢驗(yàn)的P值為0.002，差異極明顯，45個(gè)循環(huán)的平均值普遍比40個(gè)循環(huán)的平均值高0.35-1.22，而SD和CV均無(wú)明顯性差異。（4）Ct值40以上的結(jié)果：只有一個(gè)值為40.53。試驗(yàn)結(jié)論：通過(guò)增加循環(huán)數(shù)不能提高試劑本身的比較低檢測(cè)限和對(duì)低濃度樣品的檢出率。循環(huán)數(shù)增加是否會(huì)增加非特異擴(kuò)增的概率，本次試驗(yàn)未進(jìn)行驗(yàn)證。做 qPCR,不要鉆進(jìn)唯Ct值的...

因此大量有關(guān)qPCR發(fā)表的文獻(xiàn)中存在結(jié)果證據(jù)不足甚至是相互矛盾的結(jié)果，這對(duì)科學(xué)研究是一個(gè)很大的危險(xiǎn)。科學(xué)文獻(xiàn)的發(fā)表和撤回也為人們提出了警示。多數(shù)研究報(bào)告缺少足夠的信息加劇了這個(gè)問(wèn)題，使用qPCR的文獻(xiàn)沒(méi)有提供足夠的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，可以讓讀者評(píng)估結(jié)果的質(zhì)量或者重復(fù)實(shí)驗(yàn)。具體表現(xiàn)為樣本的采集和處理信息，RNA質(zhì)量和完整性，反向轉(zhuǎn)錄細(xì)節(jié)，PCR效率，以及分析參數(shù)等等，這些信息常常被忽略，然而樣本正規(guī)化是反對(duì)沒(méi)有價(jià)值的單一參考基因。為什么我的qPCR每次結(jié)果都不太一樣？陜西實(shí)時(shí)熒光qPCR機(jī)構(gòu)電話(huà)Ct 會(huì)受到閾值的影響，每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會(huì)導(dǎo)致基線(xiàn)不同，進(jìn)而影響閾值和 Ct 值。模板的Ct值與該模...

Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系：理想情況下，qPCR的模板經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)數(shù)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴(kuò)增效率E）^循環(huán)數(shù)n。但是由于E通常無(wú)法達(dá)到100%，并且在擴(kuò)增的后期，擴(kuò)增效率會(huì)逐漸降低，只有在理想的情況下才滿(mǎn)足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定。這是目前較常用的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知濃度樣品同時(shí)擴(kuò)增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得未知樣品濃度。分析定量時(shí)，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果的不...

Bio-Rad 的 qPCR 設(shè)備全系標(biāo)配 8 個(gè)溫度梯度功能，只要運(yùn)行一次實(shí)驗(yàn)，就能找到較合適的退火溫度條件。專(zhuān)門(mén)的蜂巢式反應(yīng)模塊，保證了很好的溫度均一性，即使在較快的升降溫過(guò)程中同樣如此。優(yōu)化溫度梯度實(shí)驗(yàn)中，你只需要配好 8 個(gè)組分完全相同的反應(yīng)體系（模板量適中即可）。在然后的結(jié)果中，能到得到較小 Cq 值的溫度點(diǎn)即為比較好退火溫度。通常，比較好的退火溫度是狹窄的一個(gè)范圍，而不是單一的溫度點(diǎn)，比如 57℃～58℃ 即為比較好的退火溫度。對(duì)于染料法的 qPCR 體系，還要通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析檢查各退火溫度下產(chǎn)物的特異性情況，優(yōu)先沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，且 Cq 值較小的退火溫度為較適退火溫度。qPCR...

即使操作如此簡(jiǎn)單，很多實(shí)驗(yàn)者仍然會(huì)輕視。在此建議，將溫度梯度優(yōu)化納入到預(yù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，通過(guò)qPCR的溫度梯度方法確認(rèn)比較好的Ta值。還要提醒大家，軟件預(yù)測(cè)的引物和探針的Ta值只用于參考，而且比較好Ta值會(huì)隨著反應(yīng)環(huán)境的變化而變化，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度并沒(méi)有預(yù)期的那么高，因此不能盲目迷信，比較好的Ta值仍然要通過(guò)實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)確認(rèn)。擴(kuò)增子、探針和引物：說(shuō)完退火溫度，再來(lái)聊聊擴(kuò)增子的選取、探針和引物的設(shè)計(jì)，這也是擴(kuò)增效率的重要影響因素。qPCR的好處有些什么？實(shí)時(shí)熒光定量qPCR實(shí)驗(yàn)qPCR有兩化學(xué)方法——探針?lè)ê腿玖戏?，這位童鞋選擇的是相對(duì)便宜的SYBR green染料法。但是偏有好事之徒指點(diǎn)江山，“為啥要做...

即使操作如此簡(jiǎn)單，很多實(shí)驗(yàn)者仍然會(huì)輕視。在此建議，將溫度梯度優(yōu)化納入到預(yù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，通過(guò)qPCR的溫度梯度方法確認(rèn)比較好的Ta值。還要提醒大家，軟件預(yù)測(cè)的引物和探針的Ta值只用于參考，而且比較好Ta值會(huì)隨著反應(yīng)環(huán)境的變化而變化，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度并沒(méi)有預(yù)期的那么高，因此不能盲目迷信，比較好的Ta值仍然要通過(guò)實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)確認(rèn)。擴(kuò)增子、探針和引物：說(shuō)完退火溫度，再來(lái)聊聊擴(kuò)增子的選取、探針和引物的設(shè)計(jì)，這也是擴(kuò)增效率的重要影響因素。TaqMan探針?lè)╭PCR實(shí)驗(yàn)就找上海融享生物科技有限公司。上海實(shí)時(shí)熒光qPCR公司電話(huà)1.每個(gè)qPCR試劑盒在上市前應(yīng)該按照行業(yè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各種指標(biāo)的系統(tǒng)評(píng)估，試劑盒生產(chǎn)廠(chǎng)家...

Ct 會(huì)受到閾值的影響，每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會(huì)導(dǎo)致基線(xiàn)不同，進(jìn)而影響閾值和 Ct 值。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在一定線(xiàn)性關(guān)系，起始模板量濃度越高，Ct值越?。黄鹗寄０辶繚舛仍降?，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對(duì)穩(wěn)定的。Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會(huì)存在差異。做 qPCR,不要鉆進(jìn)唯Ct值的牛角尖。吉林SYBR熒光染料qPCR公司Ct值能否作為評(píng)價(jià)qPCR試劑盒的指...

當(dāng)初始模板核酸濃度≤1 copies/μL 時(shí)，這時(shí)的影響因素不光是你能否檢測(cè)到，還取決于你每次能取到模板的概率。因?yàn)樵诘蜐舛认拢看稳〉侥０宓母怕适欠牟此煞植嫉?。不明白的可以看看（診斷試劑評(píng)價(jià)系列 4 - 比較低檢測(cè)限，你做對(duì)了嗎？）qPCR循環(huán)數(shù)試驗(yàn)：模板濃度：將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋為0.5，1，2，3，4，5copies/μL，模板上樣量2μL，每個(gè)濃度10次重復(fù)。擴(kuò)增體系：使用相同的引物探針和擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系體積為20μL。該擴(kuò)增體系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。循環(huán)數(shù)：分別進(jìn)行40個(gè)循環(huán)和45個(gè)循環(huán)，其他條件完全一致。上海融享生物科技有限公司相對(duì)定量qP...

擴(kuò)增曲線(xiàn)異常，比如S型曲線(xiàn)參比染料設(shè)定不正確：MasterMix不加參比染料時(shí)，選NONE。模板的濃度太高或者降解。熒光染料的降解。定量PCR儀的開(kāi)關(guān)機(jī)順序是怎樣的？按照正確的開(kāi)關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長(zhǎng)儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開(kāi)機(jī)順序：先開(kāi)電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開(kāi)啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開(kāi)定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，然后關(guān)閉電腦。SYBR熒光染料qPCR機(jī)構(gòu)哪家好？廣東SYBR熒光染料qPCR服務(wù) 想做好qPCR，show出漂亮的結(jié)果，糾正不良的qPCR操作...

能否通過(guò)增加擴(kuò)增循環(huán)數(shù)來(lái)增加試劑盒的敏感性？這里指的是大部分的qPCR試劑盒的循環(huán)數(shù)為40個(gè)或45個(gè)，我們能否在不改變?cè)噭┖械脑O(shè)計(jì)的前提下，只通過(guò)將40個(gè)循環(huán)增加到45個(gè)循環(huán)，或是將臨界值由38提高到40，或者由40提高到45的方式來(lái)提高試劑盒的敏感性呢？從原理上解釋?zhuān)豪碚撋希僭O(shè)初始模板量為1個(gè)拷貝，酶的擴(kuò)增效率100%，到達(dá)比較大閾值約需要35個(gè)循環(huán)，因此業(yè)內(nèi)通常認(rèn)為qPCR的有效線(xiàn)性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴(kuò)增效率無(wú)法達(dá)到100%，達(dá)到1個(gè)拷貝模板的循環(huán)數(shù)可能會(huì)達(dá)到38或更高，如下圖我用qPCR和數(shù)字PCR測(cè)到了1拷貝模板對(duì)應(yīng)的Ct值為37.91。當(dāng)酶的效率更低或者存在抑制劑時(shí)，...

LOD為檢測(cè)到陽(yáng)性樣本比較低濃度為95%。換句話(huà)說(shuō)，包含一組靶基因復(fù)制內(nèi)LOD的濃度較多不超過(guò)5%失敗反應(yīng)。低拷貝PCRs是隨機(jī)有限的，不可能出現(xiàn)LODs為3個(gè)拷貝/PCR。如果是多個(gè)反應(yīng)，可通過(guò)數(shù)字PCR得到低濃度的準(zhǔn)確定量。實(shí)際上濃度校準(zhǔn)器可以通過(guò)檢測(cè)有限的稀釋?zhuān)『统晒Ψ磻?yīng)的百分比符合Poisson分布。很多因素可以解釋qPCR結(jié)果的變異，包括溫度的差異可影響退炎和/或變性，濃度不同可由移液濃度錯(cuò)誤引起，以及隨機(jī)變異。qPCR精度的一般隨著拷貝數(shù)減少而變化。理想狀態(tài)是實(shí)驗(yàn)內(nèi)變異(重復(fù)性)在圖中應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)誤，或者重復(fù)樣本的在校準(zhǔn)曲線(xiàn)作為CIs。CVs不能用作Cqs，但是可用于表達(dá)拷貝...

除了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)上面所提到的非反轉(zhuǎn)錄控制外，所有qPCR反應(yīng)還需要更多的控制和/或量化標(biāo)準(zhǔn)。在SYBRGreenI反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)用探針區(qū)別預(yù)期PCR產(chǎn)物中區(qū)別不可預(yù)知的擴(kuò)增產(chǎn)物(如引物二聚體)時(shí)，應(yīng)用NTCs檢測(cè)PCR污染。NTCs應(yīng)當(dāng)包含在每個(gè)板或者批樣品中，并建立拒絕條件。如果Cq值未知比較高值為35，那么如NTCs的Cqs≧40可以忽略。從實(shí)驗(yàn)樣本中提取的核酸的陽(yáng)性對(duì)照可用于監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)隨時(shí)間變化，并且當(dāng)每次操作不執(zhí)行校準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)陽(yáng)性對(duì)照就必不可少。選擇一款靠譜的產(chǎn)品，一次性把 qPCR 做好，把更多的精力投入到科研思路、科研創(chuàng)造中，才能更快產(chǎn)生科研價(jià)值。河北SYBR熒光染料qPCR機(jī)構(gòu)通常...

qPCR是不是會(huì)做不好呢？即使是看了人家文獻(xiàn)里的PCR方法，照搬了人家的引物，還是做得每次結(jié)果都不一樣？其實(shí)具體原因有這么幾個(gè)。首先，你基本上不太會(huì)用移液頭。移液頭特別是微量移液頭，特別長(zhǎng)期快速操作，也就是說(shuō)彈簧沒(méi)來(lái)得及恢復(fù)又進(jìn)行下一步按壓。極其容易導(dǎo)致……你的大拇指關(guān)節(jié)受損。好吧，這都是其次，關(guān)鍵是你的移液量可能都會(huì)有變化。所以，關(guān)愛(ài)拇指，吸取液體時(shí)，保持1-2秒，給彈簧一個(gè)緩沖。當(dāng)然，在加模板的時(shí)候，提高模板加樣量，也可以盡可能減少每次加樣的誤差。吸取液體的時(shí)候，需要把頭插入凹液面底部，而不是插到凹液面的側(cè)面。側(cè)面比較容易產(chǎn)生氣泡：當(dāng)然，你會(huì)說(shuō)，每次頭都插很深，但是這樣的話(huà)，就很容易在頭上...

擴(kuò)增子是發(fā)生PCR反應(yīng)的靶標(biāo)基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標(biāo)基因的數(shù)量，并不需要得到其全長(zhǎng)序列，因此擴(kuò)增子區(qū)段的選擇具有相當(dāng)?shù)撵`活性，在基因讀碼框的內(nèi)部即可（mRNA的分析除外）。區(qū)段的選擇一般遵循以下原則：擴(kuò)增子長(zhǎng)度一般在75～200bp范圍。如果太長(zhǎng)，擴(kuò)增效率會(huì)降低；而太短又無(wú)法與引物二聚體區(qū)分開(kāi)。盡可能避免產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。這會(huì)極大的影響擴(kuò)增效率。目前很多網(wǎng)站都可以在線(xiàn)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，操作簡(jiǎn)單。盡可能避免了單堿基連續(xù)重復(fù)超過(guò)4次（如AAAA、CCCC等）。但有時(shí)在擴(kuò)真核生物基因組時(shí)難以保證。GC含量盡可能在50%～60%。這一點(diǎn)在擴(kuò)增某些物種（如放線(xiàn)菌）基因組時(shí)同樣難以保證。高GC模...

定量PCR基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？總的來(lái)說(shuō)，有三個(gè)層次的校正是必須要做的。參比信號(hào)校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號(hào)波動(dòng)都能夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映PCR進(jìn)程。ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。內(nèi)對(duì)照校正。實(shí)驗(yàn)中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來(lái)自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正到每個(gè)細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時(shí)定量一個(gè)內(nèi)對(duì)照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。內(nèi)對(duì)照校正使不同...

怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清理污染？一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個(gè)孔的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。清理樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。TaqMan熒光探針qPCR公司哪家好？湖北實(shí)時(shí)熒光qPCR哪家好相對(duì)來(lái)說(shuō)比較難解決的，就是抑制物，在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或者PCR過(guò)程中都可能有抑制物，這些...

相對(duì)來(lái)說(shuō)比較難解決的，就是抑制物，在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或者PCR過(guò)程中都可能有抑制物，這些抑制物，比如Na離子，EDTA，SDS，酚，血紅素，腐植酸等等，都會(huì)對(duì)qPCR結(jié)果產(chǎn)生影響。具體體現(xiàn)在擴(kuò)增曲線(xiàn)里會(huì)是這樣：實(shí)際上去除抑制劑也只能在抽提的過(guò)程中盡量洗脫掉抑制劑，別的操作過(guò)程中其實(shí)也沒(méi)什么辦法（加促進(jìn)劑可能又會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定因素）。好了，看看你的操作過(guò)程中是不是有這樣或者那樣的問(wèn)題，看看你的擴(kuò)增曲線(xiàn)是不是有比較奇怪的變化，然后，進(jìn)行改進(jìn)吧。上海融享生物科技有限公司實(shí)時(shí)熒光qPCR服務(wù)。貴州TaqMan探針?lè)╭PCR公司電話(huà)擴(kuò)增子是發(fā)生PCR反應(yīng)的靶標(biāo)基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標(biāo)基因的數(shù)量，并...

即使操作如此簡(jiǎn)單，很多實(shí)驗(yàn)者仍然會(huì)輕視。在此建議，將溫度梯度優(yōu)化納入到預(yù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中，通過(guò)qPCR的溫度梯度方法確認(rèn)比較好的Ta值。還要提醒大家，軟件預(yù)測(cè)的引物和探針的Ta值只用于參考，而且比較好Ta值會(huì)隨著反應(yīng)環(huán)境的變化而變化，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度并沒(méi)有預(yù)期的那么高，因此不能盲目迷信，比較好的Ta值仍然要通過(guò)實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)確認(rèn)。擴(kuò)增子、探針和引物：說(shuō)完退火溫度，再來(lái)聊聊擴(kuò)增子的選取、探針和引物的設(shè)計(jì)，這也是擴(kuò)增效率的重要影響因素。每個(gè) qPCR 試劑盒在上市前應(yīng)該按照行業(yè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各種指標(biāo)的系統(tǒng)評(píng)估。山東qPCR機(jī)構(gòu)哪里有與Ct值有關(guān)的參數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Standardcurve：模板的Ct值與該模板的起...

怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清理污染？一個(gè)辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號(hào)，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當(dāng)某個(gè)孔的信號(hào)明顯高出其他孔時(shí)，則表明該孔被污染。清理樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個(gè)污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完。相對(duì)定量qPCR實(shí)驗(yàn)就找上海融享生物科技有限公司。天津qPCR機(jī)構(gòu)哪家好與Ct值有關(guān)的參數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Standardcurve：模板的Ct值與該模板的...

規(guī)范化是一個(gè)可知的qPCR檢測(cè)重要的組成部分，因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程控制提取的變化，反轉(zhuǎn)錄的量，擴(kuò)增效率，從而可以通過(guò)不同樣本比較mRNA濃度。使用參考基因作為內(nèi)部控制是**常用規(guī)范化細(xì)胞mRNA數(shù)據(jù)的方法，但是雖然使用參考基因被大多數(shù)適當(dāng)規(guī)范化策略所接受，但是它們的用途必須為特定的組織或者細(xì)胞和特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效。不幸的是雖然大家越來(lái)越意識(shí)到系統(tǒng)性確認(rèn)的重要性，大家也知道使用不恰當(dāng)?shù)膮⒖蓟蜃鳛橐?guī)范有潛在的高度誤導(dǎo)性，但是很多人還是一直忽視這些因素。因此很多分子分析仍然包含沒(méi)有規(guī)范化的qPCR數(shù)據(jù)。規(guī)范化涉及到報(bào)告研究基因和參考基因RNA濃度的比率。參考基因的mRNA應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定表達(dá)，它們的豐...

擴(kuò)增子是發(fā)生PCR反應(yīng)的靶標(biāo)基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標(biāo)基因的數(shù)量，并不需要得到其全長(zhǎng)序列，因此擴(kuò)增子區(qū)段的選擇具有相當(dāng)?shù)撵`活性，在基因讀碼框的內(nèi)部即可（mRNA的分析除外）。區(qū)段的選擇一般遵循以下原則：擴(kuò)增子長(zhǎng)度一般在75～200bp范圍。如果太長(zhǎng)，擴(kuò)增效率會(huì)降低；而太短又無(wú)法與引物二聚體區(qū)分開(kāi)。盡可能避免產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。這會(huì)極大的影響擴(kuò)增效率。目前很多網(wǎng)站都可以在線(xiàn)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，操作簡(jiǎn)單。盡可能避免了單堿基連續(xù)重復(fù)超過(guò)4次（如AAAA、CCCC等）。但有時(shí)在擴(kuò)真核生物基因組時(shí)難以保證。GC含量盡可能在50%～60%。這一點(diǎn)在擴(kuò)增某些物種（如放線(xiàn)菌）基因組時(shí)同樣難以保證。高GC模...

熒光定量PCR（qPCR）是目前病原檢測(cè)領(lǐng)域使用j較為普遍的核酸檢測(cè)方法。尤其是非洲豬瘟和肺炎發(fā)生后，qPCR檢測(cè)得到了極大的普及，對(duì)于剛剛進(jìn)入qPCR檢測(cè)領(lǐng)域的人，很容易鉆入了「唯Ct值」的牛角尖，我們就來(lái)聊聊qPCR中的Ct值。什么是Ct值閾值循環(huán)數(shù)Thresholdcycle(Ct)也寫(xiě)作Cq值，熒光信號(hào)大于熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值設(shè)為基線(xiàn)（baseline），是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號(hào)被認(rèn)為是真實(shí)的信號(hào)，用于定義Ct值。Ct會(huì)受到閾值的影響，每次...

想做好qPCR，show出漂亮的結(jié)果，糾正不良的qPCR操作習(xí)慣，需要準(zhǔn)備以下內(nèi)容（以染料摻入法為例子）。1.設(shè)計(jì)目的基因引物。請(qǐng)參考以上內(nèi)容，上海英俊默認(rèn)是2OD，實(shí)際上2OD~5OD的價(jià)格是一樣的，5OD做幾千個(gè)樣品是沒(méi)問(wèn)題的，我每次都是設(shè)計(jì)5OD，1OD/管，每次只溶解1管，其余4管凍存-80，理論上管用n年2.設(shè)計(jì)內(nèi)參基因引物。這很重要，不同組織選擇內(nèi)參基因種類(lèi)不同，常見(jiàn)內(nèi)參有HPRT、ACTIN、UBC、UBB等等，不要人云亦云，自己去找文獻(xiàn)看看目的組織內(nèi)哪種內(nèi)參較穩(wěn)定，有錢(qián)的，需要數(shù)據(jù)可靠性高的，可以選擇2種引物，更高大上的可以做3種及以上，然后利用qbaseplus選...

熒光定量PCR（qPCR）是目前病原檢測(cè)領(lǐng)域使用j較為普遍的核酸檢測(cè)方法。尤其是非洲豬瘟和肺炎發(fā)生后，qPCR檢測(cè)得到了極大的普及，對(duì)于剛剛進(jìn)入qPCR檢測(cè)領(lǐng)域的人，很容易鉆入了「唯Ct值」的牛角尖，我們就來(lái)聊聊qPCR中的Ct值。什么是Ct值閾值循環(huán)數(shù)Thresholdcycle(Ct)也寫(xiě)作Cq值，熒光信號(hào)大于熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值設(shè)為基線(xiàn)（baseline），是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號(hào)被認(rèn)為是真實(shí)的信號(hào)，用于定義Ct值。Ct會(huì)受到閾值的影響，每次...

Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數(shù)，前提是需要樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)擴(kuò)增，定量標(biāo)準(zhǔn)品需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等定量準(zhǔn)確的物質(zhì)（OD260/280換算的的拷貝數(shù)誤差很大），即使如此定值結(jié)果仍存在一定的誤差。熒光定量PCR是否為定量方法？雖然名字里有「定量」，但是qPCR的間接定量方式又復(fù)雜，又受很多因素影響，又不準(zhǔn)確，在計(jì)量領(lǐng)域是不被認(rèn)可的。目前的核酸檢測(cè)方法中只有數(shù)字PCR是真正的定量檢測(cè)方法，其余的都是定性檢測(cè)方法。上海融享生物科技有限公司實(shí)時(shí)熒光定量qPCR服務(wù)。湖北實(shí)時(shí)熒光qPCR...

完整的探針包括熒光基團(tuán)、淬滅基團(tuán)和寡核苷酸序列三部分，理想的探針應(yīng)該具有特異性高、熒光本底低等特點(diǎn)。對(duì)于寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)一般遵循以下原則：GC含量30%～80%，C堿基要多于G堿基，長(zhǎng)度一般15～30bp。過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響淬滅效率，導(dǎo)致熒光本底較高；過(guò)短則導(dǎo)致特異性下降。Tm值一般比引物的要高5～10℃。5’端不能安置G堿基。G堿基本身具有熒光淬滅的特性，會(huì)導(dǎo)致熒光基團(tuán)被切掉后也無(wú)法發(fā)出熒光。熒光基團(tuán)根據(jù)檢測(cè)的多重性靈活選擇，一般優(yōu)先常規(guī)的 FAM 和 HEX，同時(shí)針對(duì)不同的熒光基團(tuán)選擇合適的淬滅基團(tuán)。qPCR的優(yōu)勢(shì)您了解多少呢？?jī)?nèi)蒙古TaqMan探針?lè)╭PCR公司哪里有相對(duì)來(lái)說(shuō)比較難解決的，就是...

除了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)上面所提到的非反轉(zhuǎn)錄控制外，所有qPCR反應(yīng)還需要更多的控制和/或量化標(biāo)準(zhǔn)。在SYBRGreenI反應(yīng)中應(yīng)當(dāng)用探針區(qū)別預(yù)期PCR產(chǎn)物中區(qū)別不可預(yù)知的擴(kuò)增產(chǎn)物(如引物二聚體)時(shí)，應(yīng)用NTCs檢測(cè)PCR污染。NTCs應(yīng)當(dāng)包含在每個(gè)板或者批樣品中，并建立拒絕條件。如果Cq值未知比較高值為35，那么如NTCs的Cqs≧40可以忽略。從實(shí)驗(yàn)樣本中提取的核酸的陽(yáng)性對(duì)照可用于監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)隨時(shí)間變化，并且當(dāng)每次操作不執(zhí)行校準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)陽(yáng)性對(duì)照就必不可少。qPCR的優(yōu)缺點(diǎn)您知道嗎？河北SYBRGreen法qPCR機(jī)構(gòu)哪里有qPCR有兩化學(xué)方法——探針?lè)ê腿玖戏?，這位童鞋選擇的是相對(duì)便宜的SYBR ...