中國臺(tái)灣轉(zhuǎn)染試劑檢測

轉(zhuǎn)染是將外來核酸傳遞到真核細(xì)胞中以修飾宿主細(xì)胞的遺傳組成的過程。在過去的30年里，轉(zhuǎn)染因其廣泛應(yīng)用于研究疾病的細(xì)胞過程和分子機(jī)制而越來越受歡迎。了解疾病的分子途徑，可以發(fā)現(xiàn)可能用于疾病診斷和預(yù)后的特定生物標(biāo)志物。此外，轉(zhuǎn)染可以作為基因***中的策略之一，用于***無法***的遺傳性遺傳病。***，生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步允許將不同類型的核酸轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，這些核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)以及小的非編碼RNA，如siRNA,shRNA和miRNA。通常轉(zhuǎn)染可分為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染兩種類型。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指通過將外源DNA整合到宿主核基因組中，或在宿主核中作為染色體外元件維持一個(gè)外源載體來維持轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)。該轉(zhuǎn)基因可然后通過細(xì)胞的復(fù)制進(jìn)行本構(gòu)性表達(dá)。相比之下，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不需要將核酸整合到宿主細(xì)胞基因組中。核酸可以以質(zhì)粒的形式或寡核苷酸的形式轉(zhuǎn)染。因此，隨著宿主細(xì)胞的復(fù)制，轉(zhuǎn)基因表達(dá)**終會(huì)丟失。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常用于短期研究，以研究特定基因敲入/敲入的影響。相比之下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在需要大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)的長期遺傳和藥理學(xué)研究中很有用。其結(jié)構(gòu)的一個(gè)共同特征是分子中存在許多帶正電的基團(tuán)，這些基團(tuán)被質(zhì)子化成帶正電的聚合物。中國臺(tái)灣轉(zhuǎn)染試劑檢測

脂質(zhì)顆粒的加入導(dǎo)致內(nèi)體DNA釋放增加。Delgado等人通過在腎細(xì)胞中添加魚精蛋白，設(shè)法提高了固體脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率，但與不添加魚精蛋白的對照組相比，相同的多功能單元，DNA/魚精蛋白/SLN(固體脂質(zhì)納米顆粒)，降低了HEK 293細(xì)胞系(人胚胎腎細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染效率。這給了我們希望，通過加入必要的配體的可能性，使用納米顆粒的轉(zhuǎn)染可能會(huì)調(diào)整到給定的細(xì)胞類型。Bahrami et al.經(jīng)表明，不同種類的納米顆粒以不同的方式與細(xì)胞膜結(jié)合。形成這些鍵的差異取決于它們的球形或非球形形狀，也取決于不同納米顆粒所表現(xiàn)出的各種粘附電位以及它們進(jìn)入后引起的膜形狀變化。Prabha等人的實(shí)驗(yàn)表明，納米顆粒的大小對COS-1(非洲綠猴腎細(xì)胞)和HEK 293細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率有***影響:使用較小的納米顆粒時(shí)，轉(zhuǎn)染效率分別是使用較大納米顆粒的27倍和4倍。在兩種分散體中，小顆粒和大顆粒的細(xì)胞攝取、表面電荷和DNA釋放是相同的，這表明使用納米顆粒進(jìn)行基因傳遞的效率受到許多因素的影響，它們的使用應(yīng)該根據(jù)細(xì)胞類型和應(yīng)用條件進(jìn)行具體調(diào)整。此外，用作納米顆粒分散劑的不同物質(zhì)，如十六種不同類型納米顆粒的豬肺表面活性劑和牛血清白蛋白，對其在溶液中的團(tuán)聚有***影響。陜西干細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑陽離子聚合物是一種非病毒載體。

化學(xué)轉(zhuǎn)染可分為基于脂質(zhì)體或非基于脂質(zhì)體?；谥|(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑是一種化學(xué)物質(zhì)，它能夠形成帶正電的脂質(zhì)聚集體，這些聚集體可以與宿主細(xì)胞的磷脂雙分子層順利融合，從而允許外來遺傳物質(zhì)以**小的阻力進(jìn)入。另一方面，非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑可進(jìn)一步分為幾類，包括磷酸鈣、樹狀大分子、聚合物、納米顆粒和非脂質(zhì)體。磷酸鈣是轉(zhuǎn)染中使用的低價(jià)的化學(xué)物質(zhì)之一，轉(zhuǎn)染涉及將帶正電的鈣離子(Ca2+)與帶負(fù)電的核酸結(jié)合，形成沉淀，然后被宿主細(xì)胞吸收。然而，磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功率較低，需要事先優(yōu)化才能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率。樹狀大分子是三維的、高度支化的有機(jī)大分子，可以與核酸形成復(fù)合物，作為一種替代的非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，它優(yōu)于磷酸鈣。然而，使用樹狀大分子的轉(zhuǎn)染效率仍然低于病毒載體和脂質(zhì)體試劑。陽離子聚合物也可以與帶負(fù)電荷的核酸形成復(fù)合物，這有助于細(xì)胞通過內(nèi)吞作用吸收遺傳物質(zhì)。與病毒載體相比，陽離子聚合物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性較小，但效率也較低。納米顆粒由于其體積小，增強(qiáng)了核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力，正在成為非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的替代選擇。

在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用對照對于確定所使用的轉(zhuǎn)染試劑和核酸的效果和效率至關(guān)重要。通常，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和寡核苷酸轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)都需要陽性對照、陰性對照、未轉(zhuǎn)染對照和模擬轉(zhuǎn)染對照。陽性對照是先前已被證明對轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生已知影響的DNA或RNA，例如影響特定下游遺傳靶點(diǎn)的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染工作的初始階段，需要一個(gè)陽性對照來建立一個(gè)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案，之后，陽性對照可以作為參考，與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較。另一方面，陰性對照用于確認(rèn)宿主細(xì)胞中預(yù)期的基因表達(dá)變化是否歸因于轉(zhuǎn)染而不是其他原因。在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染中，陰性對照可以是缺乏DNA和轉(zhuǎn)染載體的反應(yīng)，或者兩者都沒有，只有宿主細(xì)胞。在小RNA轉(zhuǎn)染中，陰性對照包含一個(gè)非同源序列，該序列通常是一個(gè)與靶序列具有相同核苷酸長度和組成但與任何已知哺乳動(dòng)物基因不同源的打亂序列。未轉(zhuǎn)染的對照包括不含轉(zhuǎn)染試劑和核酸的細(xì)胞培養(yǎng)，作為宿主細(xì)胞基本信息的對照，包括活力、表型，更重要的是，不受轉(zhuǎn)染影響的靶基因的基線表達(dá)水平。模擬轉(zhuǎn)染是指不含遺傳靶標(biāo)或核酸的轉(zhuǎn)染，可以評估轉(zhuǎn)染試劑(如背景自熒光噪聲)產(chǎn)生的影響。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，推薦使用空質(zhì)粒對照作為模擬轉(zhuǎn)染對照。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用對照對于確定所使用的轉(zhuǎn)染試劑和核酸的效果和效率至關(guān)重要。

影響物理轉(zhuǎn)染或機(jī)械轉(zhuǎn)染效率的因素在很大程度上取決于這些方法的基本原理。例如，電穿孔技術(shù)依賴于電場來增加宿主細(xì)胞膜的通透性，以內(nèi)化外來核酸。因此，電穿孔過程中的電壓和持續(xù)時(shí)間是決定電穿孔成功與否的重要因素。施加高壓的長時(shí)間電穿孔可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷并降低轉(zhuǎn)染效率。通過增加電脈沖的數(shù)量也可以提高電轉(zhuǎn)染效率，但這可能會(huì)降低細(xì)胞活力。另一方面，電轉(zhuǎn)染效率取決于所使用的細(xì)胞類型，每當(dāng)要電轉(zhuǎn)染一種新的細(xì)胞類型時(shí)，應(yīng)優(yōu)化電穿孔條件。一些細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞，即使在標(biāo)準(zhǔn)的電穿孔條件下也可能轉(zhuǎn)染不良，而電轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞通常可以產(chǎn)生良好的轉(zhuǎn)染結(jié)果。電穿孔緩沖液的組成是影響轉(zhuǎn)染效率的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。據(jù)報(bào)道，電穿孔緩沖液中的ATP酶抑制劑如利多卡因可提高電穿孔后的細(xì)胞活力，而使用K+-based緩沖液的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于Mg2+-based緩沖液。假設(shè)Mg2+離子在***ATP酶以恢復(fù)電穿孔后的離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以比較大限度地減少細(xì)胞死亡，但可能會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。因此，應(yīng)優(yōu)化由多種成分組成的合適的電穿孔緩沖液配方，以確保轉(zhuǎn)染效率和電穿孔后細(xì)胞活力之間的平衡。常用的物理/機(jī)械轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、聲孔、基因顯微注射和激光照射。中國臺(tái)灣轉(zhuǎn)染試劑檢測

基于病毒的轉(zhuǎn)染，或者更具體地稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，涉及使用病毒載體將特定的核酸序列帶入宿主細(xì)胞。中國臺(tái)灣轉(zhuǎn)染試劑檢測

PLL(聚L -賴氨酸)是生理?xiàng)l件下帶正電的多氨基酸,當(dāng)鏈長超過20個(gè)殘基時(shí)，它可以與質(zhì)粒DNA結(jié)合并凝聚成致密顆粒。研究人員發(fā)現(xiàn)，配體在PLL上的共價(jià)附著可通過受體介導(dǎo)的途徑***增強(qiáng)內(nèi)吞作用。例如，涎腺樣體(ASOR)是涎腺糖蛋白受體的配體，在肝細(xì)胞上表達(dá)。當(dāng)ASOR共價(jià)附著在PLL上時(shí)，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和質(zhì)粒的細(xì)胞攝取***增加。此外，與葉酸或轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)的PLL已被開發(fā)出來，并在將pDNAs轉(zhuǎn)染到*細(xì)胞中取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。另一種重要的聚氨基酸是PLO(聚L-鳥氨酸)。PLO具有PLL的特性，但轉(zhuǎn)染效率比PLL提高了10倍。Ramsay和Gumbleton證明，與PLL相比，PLO以更低的電荷(+/?)比率凝聚pDNA，并且在相同的多陽離子/pDNA質(zhì)量比下，PLO/pDNA復(fù)合物比PLL/pDNA復(fù)合物更耐破壞。然而，由于其介導(dǎo)內(nèi)體逃逸的能力較差，帶正電的多氨基酸的轉(zhuǎn)染效率仍然很低。中國臺(tái)灣轉(zhuǎn)染試劑檢測