北京個(gè)性化dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

    切片或放入4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。修片后進(jìn)行連續(xù)切片，厚度定為3μm，將連續(xù)切片漂在涼水中,讓其自然展開(kāi)，再將分開(kāi)的切片轉(zhuǎn)移到45℃的溫水中展片30秒，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片裱貼切片，將制成的組織芯片放入65℃烤箱內(nèi)烤片2小時(shí)，取出室溫冷卻，放入-4℃冰箱保存。二、ihc染色及分析常規(guī)二甲苯脫蠟3次，每次6分鐘，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分鐘，***自來(lái)水沖洗。進(jìn)行抗原修復(fù)，然后將切片放入濕盒中，pbs沖洗3×3分鐘。滴加3％h2o2孵育10分鐘，pbs沖洗3×3分鐘。甩去pbs，滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10分鐘。甩干切片，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(***稀釋根據(jù)抗體濃度來(lái)設(shè)計(jì)抗體的稀釋比例)室溫(25℃)孵育1小時(shí)，pbs沖洗3×3分鐘，滴加二抗室溫孵育30分鐘，pbs沖洗3×3分鐘，甩去pbs，用新鮮配置的dab顯色液顯色3-10分鐘。蘇木素復(fù)染20秒，pbs返藍(lán)。按照85％(3分鐘)、95％(3分鐘)、95％(3分鐘)、100％(3分鐘)、100％(3分鐘)的酒精梯度依次脫水，***兩次二甲苯透明10分鐘，中性樹(shù)膠封片。免疫組化染色結(jié)果分為：陽(yáng)性和陰性。陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞和組織特定的抗原部位才能視為陽(yáng)性。在組織染色分布清晰及細(xì)胞定位準(zhǔn)確的情況下。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)利用新一代智能技術(shù)補(bǔ)充傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的檢測(cè)模式，賦能醫(yī)療健康建設(shè)，更好地為臨床和患者服務(wù)。北京個(gè)性化dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

    使MSI檢測(cè)的靈敏性、特異性和檢測(cè)的便利度都有了明顯進(jìn)步。3．錯(cuò)配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)與PCR-MSI檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)：文獻(xiàn)報(bào)道錯(cuò)配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)與PCR-MSI檢測(cè)結(jié)果的符合率非常高，達(dá)％，因此采用任何一種方法作為MSI-Hliu的篩查方法均可接受。相比之下，免疫組織化學(xué)法：(1)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快捷、穩(wěn)定，符合病理科日常工作流程，多數(shù)基層病理科均可開(kāi)展；(2)所需組織量少，活檢標(biāo)本亦可檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果與切除標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果一致；(3)可直接提示發(fā)生缺陷的錯(cuò)配修復(fù)蛋白類型，對(duì)于后續(xù)進(jìn)行錯(cuò)配修復(fù)基因胚系突變檢測(cè)以確診Lynch綜合征有明確的指向性；(4)少數(shù)MSH6胚系突變病例的liu由于錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的功能冗余作用可不表現(xiàn)為MSI，但免疫組織化學(xué)可檢出蛋白表達(dá)缺失，因而可彌補(bǔ)PCR-MSI檢測(cè)方法的局限性。PCR-MSI檢測(cè)雖然相對(duì)復(fù)雜，費(fèi)用相對(duì)較高，但優(yōu)點(diǎn)是直接反映liu的MSI狀態(tài)，而且對(duì)于少數(shù)錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白功能異常但并不影響蛋白的轉(zhuǎn)錄和抗原性時(shí)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)可出現(xiàn)假陽(yáng)性，而PCR-MSI檢測(cè)正好可以彌補(bǔ)。四、***檢測(cè)MSI結(jié)直腸ai的必要性及推薦檢測(cè)流程區(qū)分MSI結(jié)直腸ai的臨床意義包括以下三個(gè)方面。1．提示預(yù)后：臨床研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ期結(jié)直腸ai中。安徽個(gè)性化dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)邁杰擁有StarLIMS實(shí)驗(yàn)室信息化管理系統(tǒng)，中心實(shí)驗(yàn)室獲得了中國(guó)CNAS ISO 17025實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、美國(guó)CAP認(rèn)證。

MSI和dMMR檢測(cè)的臨床應(yīng)用

?實(shí)體瘤免疫(PD-1和CTLA-4)患者的選擇

?2017年5月23日，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了默克公司的Keytruda（pembrolizumab）應(yīng)用于高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）的實(shí)體liu患者

?2017年8月1日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)百時(shí)美施貴寶的Opdivo（nivolumab）可應(yīng)用于***氟嘧啶，奧沙利鉑和伊立替康***后疾病進(jìn)展的MSI-H或dMMR的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸liu患者

?MSI和dMMR的傳統(tǒng)臨床應(yīng)用

?用于結(jié)直腸liu和子宮內(nèi)膜liu患者林奇綜合征（HNPCC）的篩查（98%美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室）

?用于結(jié)直腸liu患者的預(yù)后指標(biāo)，MSI-H患者預(yù)后較好（美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室占48%）

?作為結(jié)直腸liu患者輔助化療(5-FU和Irinotecan)的用藥指導(dǎo)

    msh6全稱為mutshomolog6()，是一種錯(cuò)配修復(fù)基因，定位于2號(hào)染色體的p臂16位上。dna錯(cuò)配修復(fù)對(duì)于超時(shí)遺傳信息完整性的維持是非常必要的。微衛(wèi)星重現(xiàn)性的改變是由于dna復(fù)制時(shí)鉸鏈不對(duì)位產(chǎn)生滑動(dòng)而導(dǎo)致的結(jié)果，又稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。突變型的錯(cuò)配修復(fù)基因常表達(dá)于高頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(msi-h)患者中，與常染色體的顯性遺傳性疾病相關(guān)，稱為遺傳性非息肉病性結(jié)直腸ai(hnpcc)，也可見(jiàn)于散發(fā)性(msi-h)結(jié)直腸ai患者。錯(cuò)配修復(fù)(mmr)蛋白是一組細(xì)胞核內(nèi)酶，存在于所有的增殖細(xì)胞內(nèi)，參與發(fā)生了dna復(fù)制過(guò)程堿基錯(cuò)配的修復(fù)。這些蛋白形成復(fù)合物(異二聚體)結(jié)合于非正常的dna并啟動(dòng)***過(guò)程。mmr蛋白的喪失導(dǎo)致增殖細(xì)胞中dna復(fù)制錯(cuò)誤的堆積，特別是位于短重復(fù)核苷酸序列基因組的區(qū)域，這種現(xiàn)象即為所謂的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(msi)，因此，細(xì)胞中的mmr蛋白的缺失與微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(msi-h)密切相關(guān)，與此相反即是微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定(msi-l)和微衛(wèi)星穩(wěn)定(mss)。人類已經(jīng)認(rèn)定的錯(cuò)配修復(fù)功能的基因有九個(gè)，其中五種和臨床關(guān)系密切，因?yàn)樵谶z傳性非息肉病性結(jié)直腸ai(hnpcc，又稱lynch綜合征)中可能發(fā)生突變，其中msh6發(fā)生頻率9％。msh2與msh6形成異二聚體復(fù)合物，當(dāng)msh2缺乏時(shí)，msh6蛋白也同樣缺失。經(jīng)多平臺(tái)平行驗(yàn)證（MSI-PCR、MSI-NGS)，一致性高，特異性好.

    當(dāng)liu細(xì)胞出現(xiàn)一種或幾種錯(cuò)配修復(fù)蛋白核表達(dá)的丟失，則提示liu為MSI-H。MLH1和MSH2作為錯(cuò)配修復(fù)復(fù)合體的共用亞單位，在發(fā)生功能缺陷時(shí)常同時(shí)伴有其同源錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)缺失。另外，如前所述，部分Lynch綜合征是由于EpCAM基因胚系突變導(dǎo)致下游MSH2基因功能缺陷所致。Musulen等發(fā)現(xiàn)，在MSH2表達(dá)缺失的liu中檢測(cè)出EpCAM蛋白缺失，與EpCAM基因突變的吻合率達(dá)100％，所以推薦將EpCAM免疫組織化學(xué)檢測(cè)加入到Lynch綜合征的篩查流程中。日常工作中用于鑒別肺腺ai與惡性間皮瘤的抗體Ber-EP4即是檢測(cè)EpCAM的常用克隆之一。免疫組織化學(xué)檢查錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失的作用如下：(1)提示哪個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生了功能缺失(表1)；(2)與MLH1啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)和／或BRAFV600E突變檢測(cè)結(jié)合，區(qū)分散發(fā)性MSI-H結(jié)直腸ai和可疑Lynch綜合征患者；(3)與EpCAM免疫組織化學(xué)檢查結(jié)合，為后續(xù)的Lynch綜合征遺傳學(xué)突變檢測(cè)提示方向。目前，4種主要的錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均已有穩(wěn)定的商品化抗體，但受組織固定、染色條件、抗體克隆號(hào)不同等因素的影響，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。在判讀免疫組織化學(xué)染色結(jié)果時(shí)應(yīng)注意：(1)內(nèi)對(duì)照是否陽(yáng)性；(2)著色部位是否為細(xì)胞核；。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)目前已完成約30+靶點(diǎn)的方法學(xué)驗(yàn)證，50+靶點(diǎn)的方法學(xué)建立。黑龍江專注dMMR抗體檢測(cè)試劑來(lái)電咨詢

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有全技術(shù)平臺(tái)及豐富的伴隨診斷開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，為藥企合作伙伴提供一體化開(kāi)發(fā)服務(wù)。北京個(gè)性化dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

    MSH2和MLH1分別與其同源錯(cuò)配修復(fù)蛋白組成復(fù)合體發(fā)揮作用。MSH2分別與MSH6、MSH3組成復(fù)合體MutSα、MutSβ。MLH1則分別與PMS2、PMS1或MLH3形成復(fù)合體MutLα、MutLβ或MutLγ。MutSα或MutSβ識(shí)別了錯(cuò)配堿基后，與DNA堿基結(jié)合，再與MutL結(jié)合，***ATP酶，水解錯(cuò)配的堿基，同時(shí)***核酸內(nèi)切酶1，切除并修復(fù)錯(cuò)配的堿基。微衛(wèi)星(microsatellite)***存在于原核及真核生物基因組中，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，但在錯(cuò)配修復(fù)基因功能發(fā)生異常時(shí)，子代細(xì)胞微衛(wèi)星的重復(fù)核苷酸數(shù)量可增多或減少，導(dǎo)致微衛(wèi)星的長(zhǎng)度不再保持一致，這種現(xiàn)象稱MSI。錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生突變或啟動(dòng)子甲基化可引起DNA錯(cuò)配修復(fù)功能的降低，導(dǎo)致MSI。很多重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)基因如Ⅱ型TGF-β、IGF2R、PTEN、BAX等的編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)含有微衛(wèi)星，錯(cuò)配修復(fù)異常導(dǎo)致的MSI可引起這些基因在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)義突變或移碼突變，這種復(fù)制錯(cuò)誤不斷累積，**終造成liu的發(fā)生，而MSI則可作為經(jīng)此途徑發(fā)生的結(jié)直腸ai的分子標(biāo)志物。人類基因組中的微衛(wèi)星位點(diǎn)很多，1998年MSI國(guó)際研究合作組織推薦對(duì)Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定的數(shù)量將結(jié)直腸ai分為高頻MSI(MSI-H。北京個(gè)性化dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)