廣東定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺來電咨詢

    本發(fā)明屬于法醫(yī)學技術領域，具體涉及基于二代測序技術檢測68個基因座的試劑盒及其使用的引物組合，尤其涉及基于二代測序技術檢測67個y-str基因座和amelogenin基因座的試劑盒及其使用的引物組合。背景技術：短串聯(lián)重復(shorttandemrepeat，str)是由2～6bp重復單位串聯(lián)組成且***存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的dna序列，是目前法醫(yī)個體識別和親子鑒定應用*****的遺傳標記。人類y染色體短串聯(lián)重復(y-chromosomeshorttandemrepeats，y-str)具有父系遺傳、缺乏重組、分型簡單、信息量大、多態(tài)性高等特點，是研究人類的起源進化、民族差異、種族差異、群體及地區(qū)分布等的有力工具。因此，y染色體str基因座多態(tài)性研究可為法醫(yī)學個體識別和親權鑒定提供重要手段，在諸如父系家族的親權鑒定、混合斑男性成分的檢測、不同男性個體混合物的分析、追溯父系遷移歷史及重構同一父系家族等方向都具有獨特的應用價值。目前，熒光標記多重擴增結合毛細管電泳(fluorescentlabeledmultiplexpcr-capillaryelectrophoresis，pcr-ce)是str分型的主流技術；常用的商業(yè)化y-str分型試劑盒有y23(promega)、y(promega)、yfiler(thermofisherscientific)和yfilerplus。邁杰dMMR抗體檢測試劑采用免疫組織化學法（IHC）檢測組織中MLH1、MSH2、MSH6 和、PMS2 四種蛋白的表達。廣東定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺來電咨詢

    2005年，羅氏推出了***款二代測序儀羅氏454，生命科學開始進入高通量測序時代。后續(xù)隨著Illumina系列測序平臺的推出，極大降低了二代測序的價格，推動了高通量測序在生命科學各個研究領域的普及。目前，高通量測序已經(jīng)成為一種常規(guī)研究方法，大量科研工作中均會用到。然而，為什么二代測序能實現(xiàn)高通量？為什么二代測序讀長如此之短？為什么reads末端測序質(zhì)量會降低？應該如何選擇測序讀長與打斷片段的長度？想要回答這些問題，都需要詳細了解二代測序的基本原理。本篇文章以典型的Illumina雙末端測序為例，詳細解析二代測序的原理。第二代測序（Next-generationsequencing，NGS）又稱為高通量測序（High-throughputsequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術。我們都知道一代測序為合成終止測序，而二代測序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實現(xiàn)邊合成邊測序（SequencingbySynthesis）。二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（一般為熒光分子標記）來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術平臺主要包括Roche的454FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然后進行同步復制。 江蘇多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺經(jīng)驗豐富邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學為生物標志物研究和伴隨診斷開發(fā)提供科學支持，多層面助力新藥研發(fā)臨床試驗。

    基于以上研究，邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學可針對患者分層及各類研究指標提供FGFR抑制劑***中生物標志物研究的整體解決方案，包含：HumanComprehensivePanelMed1CDx；定制的panFGFxpanel；QIAGENtherascreen®FGFRRGQRT-PCRKit；RNAscope檢測FGFR1/2/3/4mRNA表達；FISH（FGF19擴增）；IHC（FGF19表達）等（圖4）。圖4FGFR抑制劑相關的生物標志物整體解決方案??方案1：Med1CDxNGSpanel(601基因)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學的Med1CDx綜合panel包含原*基因、遺傳性驅(qū)動基因、細胞周期基因和免疫/炎癥相關基因等601個基因，可用于對TMB、MMR、MSI、免疫檢查點分子、**新生抗原和HLA分型等***的分析。對于FGFR抑制劑研究，該panel除了能夠檢測FGFR基因的SNV/INDEL、基因重排和擴增等異常，也可以評估已知和探索新的耐藥變異（圖5）。圖5Med1CDx基因分布??方案2：定制panelpanFGFx（40基因）值得關注的是，邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學針對FGFR抑制劑的研究研發(fā)了“小而精”的panFGFxpanel：FGFR1-4探針覆蓋基因全部外顯子，包括UTR區(qū)，覆蓋**全，同時檢測已知與未知SNV/InDel；針對融合檢測，加入了已知融合伙伴的相關探針，提高已知融合檢出率；如有新融合發(fā)現(xiàn)需求，可提供涵蓋全部內(nèi)含子區(qū)版本；針對拷貝數(shù)擴增檢測。

    67個y-str基因座分別為：dys19、dys385a/b、dyf387s1a/b、dys388、dys389-i、dys389-ii、dys390、dys391、dys392、dys393、dyf399s1、dyf404s1a/b、dys437、dys438、dys439、dys443、dys444、dys446、dys447、dys448、dys449、dys456、dys458、dys459a/b、dys460、dys481、dys485、dys504、dys505、dys508、dys510、dys518、dys520、dys522、dys527a/b、dys531、dys533、dys549、dys552、dys557、dys570、dys576、dys587、dys593、dys596、dys612、dys617、dys622、dys626、dys627、dys630、dys635、dys641、dys643、dys644、dys645、dys710、dys720、y-gata-a10、y-gata-h4；其中，dys385a/b、dyf387s1a/b、dyf404s1a/b、dys459a/b、dys527a/b分別包含兩個分型片段，dyf399s1包含三個分型片段。二、引物組合的制備1、人工設計并合成用于擴增每個基因座的引物(要求擴增長度**好300bp以下)，然后進行pcr擴增，獲得每個基因座的特異性擴增產(chǎn)物。2、綜合單個基因座的擴增條件，選擇適宜擴增程序，進行復合擴增。由于復合的基因座數(shù)目較多，引物間相互抑制情況復雜，所以需要一一排除，找出這些基因座，重新設計并合成引物。此外，不同基因座的引物之間還會形成引物二聚體。 PMS2抗體試劑 蘇蘇械備20180570號.

    目前市場上**成功的商業(yè)化多重PCR建庫技術是ThermoFisher公司的Ampliseq技術，該技術可以在同一孔反應中完成上千對引物的擴增，使得多個靶標區(qū)域的富集可以通過一次PCR反應完成，隨后加上IonTorrent測序平臺的通用接頭建好文庫用于二代測序。然而，這個產(chǎn)品存在**大的缺陷是客戶定制化的panel設計生產(chǎn)周期較長，需要兩到三個月，嚴重的增加了時間成本；并且每個樣本的建庫費用高達1000-2000元，致使其經(jīng)濟成本極高；另外該試劑盒只適用于IonTorrent測序平臺，受平臺因素影響大，亦不利于測序費用的降低。技術實現(xiàn)要素：鑒于以上問題，本發(fā)明提供了一種基于多重PCR的二代測序建庫技術，該技術可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問題，對于客戶定制化的panel設計生產(chǎn)周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個樣本建庫的成本，且在IonTorrent和Illumina測序平臺都通用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：本發(fā)明中用到了兩輪多重PCR來建庫。首先針對每個靶標區(qū)域或者靶標位點，需要設計兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測序平臺通用的測序接頭。上游的引物OP用于***輪多重PCR。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學有多年的藥企服務經(jīng)驗，緊跟藥物研發(fā)趨勢，熟悉新藥研發(fā)動向。吉林多組學邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺誠信合作

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學目前已完成約30+靶點的方法學驗證，50+靶點的方法學建立。廣東定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺來電咨詢

    反應體系為20μl，由10μl2×mastermix(德國qiagen公司)、1μl標準品2800m水溶液、引物混合物和無核酶水組成。該反應體系中，各個引物的濃度見表1中第5列。反應程序：95℃5min；95℃30s，60℃2min，72℃2min，28個循環(huán)；72℃5min；4℃保存。3、純化和定量(1)取pcr擴增產(chǎn)物，按照pcrpurificationkit的說明書步驟進行純化，得到pcr純化產(chǎn)物。(2)將pcr純化產(chǎn)物按照qubittmdsdnahsassaykit說明書，采用，得到pcr純化產(chǎn)物的濃度。4、文庫制備取pcr純化產(chǎn)物，按照truseqdnapcr-freehtlibraryprepkit的說明書操作步驟依次進行末端修復、末端修復產(chǎn)物純化、連接a-tail、連接adapter和連接產(chǎn)物的純化，然后按照kapalibraryquantificationkit的說明書步驟進行文庫定量及文庫標準化，完成文庫制備。5、上樣測試取步驟4制備的文庫，使用miseqreagentkitv3-600cycles測序試劑于miseqfgx二代測序儀上進行測序。6、數(shù)據(jù)分析測序結束后儀器自動生成fastq文件，使用。運行，在notepad中錄入68個基因座基因配置文件?；蜃蚺渲梦募缦拢孩倩蜃Q，②y，③正向引物后12個堿基，④反向引物前12個堿基的反向互補序列，⑤該基因座**序列的兩個重復單元，⑥一個重復單元的堿基數(shù)。廣東定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺來電咨詢