河南多組學邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺經(jīng)驗豐富

    不同的二代測序平臺的區(qū)別主要體現(xiàn)在測序反應的技術上，這些差別可以分為4類：焦磷酸測序，合成法測序，連接法測序和離子半導體測序。焦磷酸測序在焦磷酸測序中，測序反應通過每個核苷酸結合過程中釋放的焦磷酸來調(diào)控。釋放的焦磷酸參與了一系列化學反應從而導致鏈光的產(chǎn)***出的光由記錄基因蔟相應序列的相機來檢測。測序反應開始后，先一次孵育一個堿基，測量光發(fā)射情況（如果有的話），在降解未參與反應的堿基，***加入另一個堿基。這項技術能夠產(chǎn)生較大的讀取長度，已經(jīng)可以與Sanger測序法得到的讀取長度相比較。然而，高昂的試劑花費，和有6個或以上的均聚物會產(chǎn)生的高錯誤率阻礙了這個技術的應用。合成法測序合成測序法是使用可逆熒光和終止核苷酸的分步整合的方法進行DNA測序，并已被llluminaNGS平臺使用。首先在測序芯片中同時加入四種核苷酸，核苷酸結合之后，剩余的DNA堿基就會被洗滌去除。每個基因蔟中熒光信號被讀取和記錄之后，這個過程一直重復直到測序反應完成。這個系統(tǒng)能通過一次只結合一個核苷酸來克服焦磷酸測序的缺點。然而，當測序反應進行時，儀器的錯誤率也在增加。這是因為去除不完全的熒光信號會導致更高的背景噪聲。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學擁有專業(yè)的病理醫(yī)生提供相應的閱片或遠程病理閱片服務。河南多組學邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺經(jīng)驗豐富

    于是，每個反應會產(chǎn)生許多不同長度的DN**段，并在模版的任一核苷酸位置上由其中一種雙脫氧核糖核苷酸終止鏈的延伸。反應混合物可以通過手動灌膠或自動灌膠到用毛細管進入測序機器，再根據(jù)DNA分子大小不同用電泳分離DNA。當DNA流過凝膠后，DNA序列可以通過雙脫氧核糖核苷酸上發(fā)出的熒光來進行分析。當今的Sanger測序儀使用的是毛細管自動上樣的凝膠電泳，一般可以同時分析8-96個系列反應。二代測序系統(tǒng)在十年前就是因其可同時進行大量平行測序反應而廣為人知。這些系統(tǒng)可以同時分析百萬甚至上億個序列反應。雖然不同的機器生產(chǎn)時會在技術細節(jié)上有許多不同，但他們都有以下幾個共同點：1,文庫建立：所有二代測序的平臺都需要一個基因文庫，這個基因文庫包含通過引申或者連接自定義的接頭序列。2,測序儀器：每個文庫片段在共階吸附的DNA連接因子的作用下，以文庫適配序列為模版，在固體表面上進行擴增。這步擴增會產(chǎn)生許多DNA蔟，每個來源于一個文庫片段，每個基因蔟都會像**的測序反應一樣起作用。3,數(shù)據(jù)輸出：每個儀器都會在測序結束后給出原始數(shù)據(jù)。這個原始數(shù)據(jù)時每個基因蔟中形成的DNA序列的**。作者：麗舍咨詢鏈接：源：知乎著作權歸作者所有。 北京定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺口碑推薦邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學同時擁有符合GMP和ISO 13485的要求的GMP生產(chǎn)車間及倉儲，可以充分滿足客戶的需求。

    目前市場上**成功的商業(yè)化多重PCR建庫技術是ThermoFisher公司的Ampliseq技術，該技術可以在同一孔反應中完成上千對引物的擴增，使得多個靶標區(qū)域的富集可以通過一次PCR反應完成，隨后加上IonTorrent測序平臺的通用接頭建好文庫用于二代測序。然而，這個產(chǎn)品存在**大的缺陷是客戶定制化的panel設計生產(chǎn)周期較長，需要兩到三個月，嚴重的增加了時間成本；并且每個樣本的建庫費用高達1000-2000元，致使其經(jīng)濟成本極高；另外該試劑盒只適用于IonTorrent測序平臺，受平臺因素影響大，亦不利于測序費用的降低。技術實現(xiàn)要素：鑒于以上問題，本發(fā)明提供了一種基于多重PCR的二代測序建庫技術，該技術可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問題，對于客戶定制化的panel設計生產(chǎn)周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個樣本建庫的成本，且在IonTorrent和Illumina測序平臺都通用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：本發(fā)明中用到了兩輪多重PCR來建庫。首先針對每個靶標區(qū)域或者靶標位點，需要設計兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測序平臺通用的測序接頭。上游的引物OP用于***輪多重PCR。

    2005年，羅氏推出了***款二代測序儀羅氏454，生命科學開始進入高通量測序時代。后續(xù)隨著Illumina系列測序平臺的推出，極大降低了二代測序的價格，推動了高通量測序在生命科學各個研究領域的普及。目前，高通量測序已經(jīng)成為一種常規(guī)研究方法，大量科研工作中均會用到。然而，為什么二代測序能實現(xiàn)高通量？為什么二代測序讀長如此之短？為什么reads末端測序質(zhì)量會降低？應該如何選擇測序讀長與打斷片段的長度？想要回答這些問題，都需要詳細了解二代測序的基本原理。本篇文章以典型的Illumina雙末端測序為例，詳細解析二代測序的原理。第二代測序（Next-generationsequencing，NGS）又稱為高通量測序（High-throughputsequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術。我們都知道一代測序為合成終止測序，而二代測序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實現(xiàn)邊合成邊測序（SequencingbySynthesis）。二代測序在DNA復制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標記（一般為熒光分子標記）來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術平臺主要包括Roche的454FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代測序中，單個DNA分子必須擴增成由相同DNA組成的基因簇，然后進行同步復制。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學具備從樣本制備到H&E，IHC、FISH、RNAscope及多重免疫組化等全套組織病理和分子病理檢測能力。

    3、主要平臺提供方ABI公司三、二代測序簡介1、Roche454測序:454測序是大規(guī)模平行測序的開始。2003年底，454公司推出了基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)—(GS)。2005年454公司被羅氏診斷公司收購，之后優(yōu)化推出GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。羅森博格博士是該技術的創(chuàng)始人,也是IonTorrent平臺的創(chuàng)始人。454平臺的突出優(yōu)勢是長讀長(400nt)，但準確率低，成本高。是高通量測序的過渡。454測序技術的具體步驟為：（1）構建測序文庫。將基因組DNA打碎成300～800個堿基片段后，在兩端加上錨定接頭；（2）PCR擴增。擴增產(chǎn)生成千上萬個拷貝；（3）焦磷酸測序。復制過程中如果發(fā)生堿基互補配對，就會釋放1個焦磷酸，在一系列酶的催化下，釋放出熒光信號，會被CCD捕獲到。每個堿基反應都會捕獲到1個熒光信號，由此一一對應，模板的堿基序列由此獲得。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者獲得授權，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請注明出處。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學病理檢測平臺配備有Roche/Leica/Dako等多種全自動檢測儀器，有病理醫(yī)生進行精確的判讀。北京定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺口碑推薦

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    ***代測序技術1975年由FrederickSanger所提出的鏈終止法以及1977年由WalterGibert所發(fā)明的鏈降解法被稱為***代測序技術。1977年，WalterGilbert和FrederickSanger發(fā)明了***臺測序儀，并應用其測定了***個基因組序列，噬菌體X174，全長5375個堿基。WalterGilbert和FrederickSanger也因在測序技術中的貢獻獲得了1980年諾貝爾化學獎。技術原理目前，基于***代測序技術的測序儀幾乎都是采用Sanger提出的鏈終止法。鏈終止法測序的**原理是ddNTP的2'和3'端都不含羥基，因此在合成核酸鏈的過程中無法形成磷酸二酯鍵，從而導致DNA合成反應中斷。在測定待測核酸片段的序列時，向反應體系中加入一定比例的帶有放射性同位素標記的4種ddNTP，利用DNA聚合酶來延伸結合在待測核酸模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止，**終會得到一組長度各相差一個堿基的鏈終止產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可通過高分辨率變性凝膠電泳分離并根據(jù)其長度排序，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影進行檢測，從而確定目的核酸片段各個位置的堿基。完整的測序過程分為4步：：如要利用Sanger測序方法進行完整基因組的測定，首先要將提取得到的樣品完整DNA打碎，形成DN**段，如只是測定單個目的基因的序列。 河南多組學邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學NGS平臺經(jīng)驗豐富