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    01FGFR簡(jiǎn)介及信號(hào)通路成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)是高度保守、***分布的跨膜酪氨酸激酶受體，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4四種受體亞型。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）與FGFR結(jié)合時(shí)，受體二聚化，從而引起受體激酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)磷酸化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1]。由FGFR***的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括RAS–RAF–MAPK，PI3K–AKT，STAT和PLC途徑，它們參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程，如***發(fā)育、血管新生、細(xì)胞增殖、遷移、抗凋亡等（圖1）。圖1FGFR信號(hào)通路[2-4]當(dāng)FGFR發(fā)生突變或者過(guò)表達(dá)時(shí)，會(huì)引起四個(gè)關(guān)鍵的下游信號(hào)通路的過(guò)度***，并進(jìn)一步誘發(fā)正常細(xì)胞*變：RAS-RAF-MAPK和PI3K-AKT過(guò)度***可分別刺激細(xì)胞增殖與分化及抑制細(xì)胞凋亡；SATA與促進(jìn)**侵襲和轉(zhuǎn)移，****逃逸能力密切相關(guān)；PLCγ信號(hào)通路則是**細(xì)胞轉(zhuǎn)移調(diào)控的重要途徑。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)致力于解決創(chuàng)新藥物的研發(fā)痛點(diǎn)及患者的用藥痛點(diǎn)，助力精zhun醫(yī)療！遼寧抗體全邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)共同合作

    三代測(cè)序簡(jiǎn)介1、HelicoBioScience2008年4月，HelicoBioScience報(bào)道了單分子測(cè)序技術(shù)，讀取單分子熒光的能力，是***家商業(yè)化單分子測(cè)序技術(shù)的公司，但儀器過(guò)于較貴，數(shù)據(jù)質(zhì)量較差，于2010年停止運(yùn)營(yíng)。2、PacificBiosciences單分子實(shí)時(shí)技術(shù)（singlemoleculerealtime,SMRT）利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測(cè)序產(chǎn)物，在測(cè)序速度、讀長(zhǎng)和成本方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力，但目前讀取速度偏低。以對(duì)單分子DNA進(jìn)行非PCR測(cè)序?yàn)橹饕卣鳎ǘ鷾y(cè)序平臺(tái)基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過(guò)程），長(zhǎng)讀長(zhǎng)，實(shí)時(shí)，單分子等，但三代測(cè)序基于單分子酶學(xué)或者單分子電學(xué)，信號(hào)容易丟失，通量不高，單堿基的測(cè)序成本也居高不下。目前主要有RSII和sequel兩款測(cè)序儀。3、納米孔測(cè)序OxfordNanopore：納米孔測(cè)序的原理可以簡(jiǎn)單地描述為：?jiǎn)蝹€(gè)堿基通過(guò)納米尺度的通道時(shí)，會(huì)引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化。理論上，A、C、G、T四種不同的堿基由于化學(xué)性質(zhì)的差異，它們穿越納米孔時(shí)引起的電學(xué)參數(shù)變化量也有差異，檢測(cè)這些變化量，即可得到相應(yīng)堿基的類型。 遼寧抗體全邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)共同合作邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)致力于解決創(chuàng)新藥物的研發(fā)痛點(diǎn)及患者的用藥痛點(diǎn)，助力精z準(zhǔn)醫(yī)療！

    實(shí)施例3、實(shí)施例1制備的試劑盒的準(zhǔn)確性驗(yàn)證1、取1ng標(biāo)準(zhǔn)品2800m、樣本一、樣本二或樣本三(見實(shí)施例2中步驟二)，按照yfilerpluspcramplifcationkit(thermofisherscientific)的說(shuō)明書步驟進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，得到各個(gè)基因座的等位基因基因型。分型結(jié)果見表4。表4注：m為毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)的分型結(jié)果，e為二代測(cè)序技術(shù)的分型結(jié)果。2、按照實(shí)施例2中步驟一的方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品2800m、樣本一、樣本二或樣本三，得到各個(gè)基因座的等位基因基因型。分型結(jié)果見表4。結(jié)果表明，實(shí)施例1制備的試劑盒與yfilerpluspcramplifcationkit重合的基因座，在標(biāo)準(zhǔn)品2800m、樣本一、樣本二和樣本三中的分型結(jié)果完全一致。實(shí)施例4、實(shí)施例1制備的試劑盒中引物具有不可替換性實(shí)施例1制備的試劑盒是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)獲得的，主要包括擴(kuò)增各個(gè)基因座引物的反復(fù)調(diào)試和引物濃度的摸索。由于復(fù)合的基因座數(shù)目較多，引物間相互抑制情況復(fù)雜，所以試劑盒中用于擴(kuò)增各個(gè)基因座的引物不可替換。1、設(shè)計(jì)并合成表5中第2列所示的、用于擴(kuò)增65個(gè)str基因座的引物，然后混合，獲得引物混合物1。設(shè)計(jì)并合成表5中第4列所示的、用于擴(kuò)增66個(gè)str基因座的引物，然后混合，獲得引物混合物2。

    目前市場(chǎng)上**成功的商業(yè)化多重PCR建庫(kù)技術(shù)是ThermoFisher公司的Ampliseq技術(shù)，該技術(shù)可以在同一孔反應(yīng)中完成上千對(duì)引物的擴(kuò)增，使得多個(gè)靶標(biāo)區(qū)域的富集可以通過(guò)一次PCR反應(yīng)完成，隨后加上IonTorrent測(cè)序平臺(tái)的通用接頭建好文庫(kù)用于二代測(cè)序。然而，這個(gè)產(chǎn)品存在**大的缺陷是客戶定制化的panel設(shè)計(jì)生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，需要兩到三個(gè)月，嚴(yán)重的增加了時(shí)間成本；并且每個(gè)樣本的建庫(kù)費(fèi)用高達(dá)1000-2000元，致使其經(jīng)濟(jì)成本極高；另外該試劑盒只適用于IonTorrent測(cè)序平臺(tái)，受平臺(tái)因素影響大，亦不利于測(cè)序費(fèi)用的降低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于多重PCR的二代測(cè)序建庫(kù)技術(shù)，該技術(shù)可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問(wèn)題，對(duì)于客戶定制化的panel設(shè)計(jì)生產(chǎn)周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個(gè)樣本建庫(kù)的成本，且在IonTorrent和Illumina測(cè)序平臺(tái)都通用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明中用到了兩輪多重PCR來(lái)建庫(kù)。首先針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)區(qū)域或者靶標(biāo)位點(diǎn)，需要設(shè)計(jì)兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測(cè)序平臺(tái)通用的測(cè)序接頭。上游的引物OP用于***輪多重PCR。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)基于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)及病理學(xué)等綜合性轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)全平臺(tái)。

    包括67個(gè)y-str基因座和1個(gè)性別決定基因座amelogenin)。相比于illumina公司的forenseqtmdnasignatureprepkit，本發(fā)明提供的試劑盒中包含41個(gè)新的y-str基因座，能提供更多新的遺傳信息。而且本發(fā)明提供的復(fù)合擴(kuò)增體系中所有y-str基因座的**大擴(kuò)增子長(zhǎng)度都小于300bp，而forenseqtmdnasignatureprepkit中有約％(7/24)基因座的**大擴(kuò)增子長(zhǎng)度大于300bp，不利于降解檢材的分析。本發(fā)明提供的試劑盒是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)摸索獲得的，試劑盒中的引物具有不可替換性；即引物被替換后，部分基因座將會(huì)被抑制且抑制效果不可預(yù)知。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品2800m中68個(gè)基因座的str分型，分型結(jié)果準(zhǔn)確。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為67個(gè)y-str基因座的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍分布。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。標(biāo)準(zhǔn)品2800m為promega公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為dd7251。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)--伴隨診斷整體解決方案提供者,檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)全涵蓋.遼寧抗體全邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)共同合作

邁杰多平臺(tái)的研究?jī)?yōu)勢(shì)以及多組學(xué)數(shù)據(jù)的挖掘能力，促進(jìn)產(chǎn)學(xué)研醫(yī)結(jié)合，加速項(xiàng)目成果轉(zhuǎn)化，創(chuàng)新科技產(chǎn)品研發(fā)。遼寧抗體全邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)共同合作

    PacBio技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)PacBio技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需PCR擴(kuò)增，不會(huì)人為的引入突變；超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，平均讀長(zhǎng)可達(dá)到10Kb，**長(zhǎng)讀長(zhǎng)可以達(dá)到40Kb；覆蓋均勻，無(wú)GC偏好性；通過(guò)reads的自我矯正，10X以上準(zhǔn)確率能夠達(dá)到；可以直接檢測(cè)到甲基化信息，同步進(jìn)行表觀遺傳學(xué)識(shí)別。PacBio技術(shù)的缺點(diǎn)：?jiǎn)螚l序列錯(cuò)誤率較高，平均核苷酸準(zhǔn)確性不到85%；測(cè)序成本較貴。PacBio技術(shù)的應(yīng)用基因組組裝利用PacBio測(cè)序平臺(tái)，可以克服部分序列GC含量高或重復(fù)序列多等問(wèn)題，更好的進(jìn)行基因組詳細(xì)描繪，從而進(jìn)行精細(xì)的基因注釋等研究。PacBio測(cè)序平臺(tái)不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此可以減少基因組組裝過(guò)程中的人為錯(cuò)誤和偏差。PacBio測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，因此相比二代測(cè)序拼接結(jié)果更為準(zhǔn)確，同時(shí)可以利用其長(zhǎng)片段來(lái)填補(bǔ)二代數(shù)據(jù)組裝中產(chǎn)生的gap和連接contig為scaffold。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序利用PacBio測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)較長(zhǎng)的特點(diǎn)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以直接得到轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)序列，省去了二代測(cè)序的拼接過(guò)程，使得過(guò)程更為簡(jiǎn)便，結(jié)果更為準(zhǔn)確。 遼寧抗體全邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)共同合作