廣東溶瘤病毒檢測創(chuàng)新服務(wù)

    **細(xì)胞通常會表現(xiàn)出與原代**細(xì)胞不同的生物學(xué)特性，比如在基因型上產(chǎn)生突變、表型上生長更快或者對特定藥物敏感性增加等，因此，常規(guī)**細(xì)胞系無法真實(shí)模擬患者體內(nèi)的**組織的生物學(xué)特性。本公開的發(fā)明人嘗試?yán)?*類***作為溶瘤病毒有效性檢測的**細(xì)胞模型，出乎意料地發(fā)現(xiàn)其檢測結(jié)果能較真實(shí)地檢測溶瘤病毒在患者體內(nèi)對**組織溶瘤作用的有效性。在上述技術(shù)方案中，***培養(yǎng)物中溶瘤病毒的復(fù)制水**映的是溶瘤病毒*****細(xì)胞后繼續(xù)復(fù)制增殖的能力，***培養(yǎng)物中溶瘤病毒的復(fù)制水平越高，表明溶瘤病毒*****細(xì)胞后繼續(xù)復(fù)制增殖的能力越強(qiáng)，*****細(xì)胞后繼續(xù)復(fù)制增殖能力強(qiáng)的溶瘤病毒能在**細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)復(fù)制產(chǎn)生更多的溶瘤細(xì)胞，從而進(jìn)一步提高溶瘤細(xì)胞殺傷**組織的效果；第二培養(yǎng)物中溶瘤病毒對**細(xì)胞的殺傷率反映的是溶瘤病毒*****細(xì)胞后殺傷**細(xì)胞的能力，第二培養(yǎng)物中溶瘤病毒對**細(xì)胞的殺傷率越高，表明溶瘤病毒*****細(xì)胞后殺傷**細(xì)胞的能力越強(qiáng)；第三培養(yǎng)物中溶瘤病毒的細(xì)胞因子促表達(dá)能力，反映的是溶瘤病毒*****細(xì)胞后誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗**免疫作用的能力，第三培養(yǎng)物中的白細(xì)胞介素-2和/或γ-干擾素的水平越高，溶瘤病毒的細(xì)胞因子促表達(dá)能力越強(qiáng)。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)同時(shí)擁有符合GMP和ISO 13485的要求的GMP生產(chǎn)車間及倉儲，可以充分滿足客戶的需求。廣東溶瘤病毒檢測創(chuàng)新服務(wù)

    使用肺*經(jīng)2d培養(yǎng)的a549細(xì)胞系替換步驟2中的肺***類***，并以正常胚肺成纖維細(xì)胞系mrc-5作為陰性對照，放入培養(yǎng)箱中與培養(yǎng)24小時(shí)后，使用(將新城疫病毒ndv溶瘤病毒作為待測溶瘤病毒，將腺病毒prostatak溶瘤病毒作為參比溶瘤病毒)***，檢測溶瘤病毒對**細(xì)胞的殺傷率。檢測結(jié)果見表2。對比例3按照實(shí)施例中步驟3的方法進(jìn)行培養(yǎng)，不同的是，使用肺*經(jīng)2d培養(yǎng)的a549細(xì)胞系替換步驟2中的肺***類***，并以正常胚肺成纖維細(xì)胞系mrc-5作為陰性對照，放入培養(yǎng)箱中與培養(yǎng)24小時(shí)后，使用(將新城疫病毒ndv溶瘤病毒作為待測溶瘤病毒，將腺病毒prostatak溶瘤病毒作為參比溶瘤病毒)***，檢測上清液中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2和γ-干擾素的濃度，并計(jì)算溶瘤病毒的細(xì)胞因子促表達(dá)能力。檢測結(jié)果見表3。表1由表1可以看出，ndv溶瘤病毒及prostatak溶瘤病毒在a549細(xì)胞系和肺*類***中均可以復(fù)制擴(kuò)增，但是ndv溶瘤病毒及prostatak溶瘤病毒在肺*類***中的復(fù)制水平均弱于其在a549細(xì)胞系中的復(fù)制水平，說明肺*類***具有的**微環(huán)境能夠影響溶瘤病毒在**細(xì)胞中的復(fù)制。肺*類***中，ndv溶瘤病毒復(fù)制能力弱于prostatak溶瘤病毒；a549細(xì)胞系中，ndv溶瘤病毒復(fù)制能力優(yōu)于prostatak溶瘤病毒。表2由表2可以看出。天津溶瘤病毒檢測值得推薦邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)有多年的藥企服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，緊跟藥物研發(fā)趨勢，熟悉新藥研發(fā)動向。

    溶瘤病毒*****細(xì)胞后誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗**免疫作用的能力也越強(qiáng)。本公開的方法通過上述三方面檢測，能夠***表征溶瘤病毒殺傷**細(xì)胞的有效性。本公開的上述方法采用**類***作為溶瘤病毒有效性檢測的**細(xì)胞模型，由于**類***能夠較好地反映患者體內(nèi)**組織的生物學(xué)特性，因此，本公開方法的檢測結(jié)果能較真實(shí)地反映溶瘤病毒在患者體內(nèi)對**組織溶瘤作用的有效性。根據(jù)本公開，推薦地，步驟a中還包括將**類***進(jìn)行***預(yù)培養(yǎng)的步驟，然后再將***預(yù)培養(yǎng)后的**類***與溶瘤病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)；所述***預(yù)培養(yǎng)包括：將**類***與溫敏性水凝膠、**類***培養(yǎng)液混合，培養(yǎng)12-96h，其中，相對于5000-10000個(gè)**類***中的**細(xì)胞，溫敏性水凝膠的用量為500-1000μl，**類***培養(yǎng)液的用量為2000-3000μl；將**類***與溶瘤病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，溶瘤病毒的用量為；步驟b中還包括將**類***進(jìn)行第二預(yù)培養(yǎng)的步驟，然后再將第二預(yù)培養(yǎng)后的**類***與溶瘤病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)；所述第二預(yù)培養(yǎng)包括：將**類***與溫敏性水凝膠、**類***培養(yǎng)液混合，培養(yǎng)12-96h，其中，相對于300-1000個(gè)**類***中的**細(xì)胞，溫敏性水凝膠的用量為30-80μl，**類***培養(yǎng)液的用量為100-150μl。

    2、檢測ganranzhong劉類***中zhong劉細(xì)胞后的溶瘤病毒的復(fù)制水平在6孔板中接種zhong劉類***細(xì)胞懸液，以使zhong劉細(xì)胞的數(shù)量為6000個(gè)/孔，其中，每孔含500μlcosmo溫敏性水凝膠及zhong劉類***培養(yǎng)液；將接種后的6孔板放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)96小時(shí)后取出，使用(將新城疫病毒ndv溶瘤病毒作為待測溶瘤病毒，將腺病毒prostatak溶瘤病毒作為參比溶瘤病毒)分別ganranzhong劉類***24，48和72小時(shí)；收集類***細(xì)胞和培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞上清，凍融3次，離心收集上清，得到待測病毒液；在96孔板中接種溶瘤病毒的宿主細(xì)胞(如新城疫病毒ndv的宿主細(xì)胞為df1細(xì)胞)懸液(100μl/孔)，放入培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)；將待測病毒液10倍比稀釋(10-1-10-11)，并分別加入96孔板的每列，每個(gè)稀釋梯度的病毒8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)37℃培養(yǎng)5～7天后觀察病變，計(jì)算病毒滴度，滴度用reed-muench兩氏法精確算出。測試結(jié)果如表1。3、檢測溶瘤病毒對zhong劉類***中zhong劉細(xì)胞的殺傷率在96孔板中接種zhong劉類***細(xì)胞懸液，以使每孔中含有400-700個(gè)zhong劉細(xì)胞，其中，每孔含40μlcosmo溫敏性水凝膠及150μl類***培養(yǎng)液；將接種后的96孔板放入培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)96小時(shí)后取出，使用。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)設(shè)有病原體檢測平臺Qiastat-Dx進(jìn)行呼吸道及胃腸道病原體檢測。

    然后使用連接酶將上述回收產(chǎn)物連接，構(gòu)建成pshuttle-e1a-e1b質(zhì)粒，其中連接反應(yīng)體系如下：將上述反應(yīng)體系置于16℃水浴鍋中反應(yīng)2小時(shí)。連接產(chǎn)物即為質(zhì)粒pshuttle-e1a-e1b。使用noti、xbai雙酶切pshuttle-e1a-e1b質(zhì)粒，回收大片段(載體片段)。然后使用ligationhigh連接酶(toyobo)將酶切后的核酸片段和載體片段連接起來，連接體系為：16℃水浴2小時(shí)，隨后將連接產(chǎn)物純化后即得到pshuttle-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b。2、重組質(zhì)粒pad-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b的構(gòu)建(1)利用pmei酶對pshuttle-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b進(jìn)行單酶切線性化，反應(yīng)體系如下：將上述反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中反應(yīng)1小時(shí)，隨后繼續(xù)進(jìn)行下一步去磷酸化實(shí)驗(yàn)。(2)利用fastap對步驟(1)中經(jīng)過線性化的pshuttle-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化處理，反應(yīng)體系如下：將上述反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中1小時(shí)，隨后進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(3)在bj5183感受態(tài)細(xì)胞中重組腺病毒骨架質(zhì)粒與線性化的pshuttle-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b，從而獲得重組質(zhì)粒pad-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b，具體步驟如下：①取上步實(shí)驗(yàn)中的線性化的pshuttle-ifn-3-sp-e1a(δ24bp)-e1b，轉(zhuǎn)化bj5183感受態(tài)細(xì)胞，涂板，挑菌，并搖菌過夜。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供完整的多平臺多組學(xué)服務(wù)，打造流程化yao企業(yè)合作。廣東溶瘤病毒檢測創(chuàng)新服務(wù)

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    該方法包括：a、將溶瘤病毒與**類***混合培養(yǎng)12-96h，得到***培養(yǎng)物，檢測所述***培養(yǎng)物中的溶瘤病毒的復(fù)制水平；b、將所述溶瘤病毒與**類***混合培養(yǎng)12-96h，得到第二培養(yǎng)物，檢測所述第二培養(yǎng)物中溶瘤病毒對**細(xì)胞的殺傷率；c、將所述溶瘤病毒、免疫細(xì)胞和**類***混合培養(yǎng)2-8h，得到第三培養(yǎng)物，檢測所述第三培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子水平并計(jì)算所述溶瘤病毒的細(xì)胞因子促表達(dá)能力，所述細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2和/或γ-干擾素；如果待測溶瘤病毒的復(fù)制水平、對**細(xì)胞的殺傷率和細(xì)胞因子促表達(dá)能力均高于參比溶瘤病毒，則指示所述待測溶瘤病毒的有效性高于所述參比溶瘤病毒。本公開的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的溶瘤病毒有效性檢測方法檢測得到的溶瘤病毒有效性數(shù)據(jù)與臨床研究階段得到的溶瘤病毒有效性數(shù)據(jù)存在較大差異的可能原因在于：現(xiàn)有的溶瘤病毒有效性檢測方法中采用的**細(xì)胞模型無法真實(shí)模擬患者體內(nèi)的**組織的生物學(xué)特性，導(dǎo)致現(xiàn)有的溶瘤病毒有效性檢測過程無法真實(shí)模擬溶瘤病毒在患者體內(nèi)的作用過程，例如，現(xiàn)有溶瘤病毒有效性檢測方法中采用的由**細(xì)胞經(jīng)2d培養(yǎng)得到的單層細(xì)胞系，其無法體現(xiàn)**異質(zhì)性，也無法模擬患者體內(nèi)的微環(huán)境，而且隨著常規(guī)**細(xì)胞系傳代代次的增加。廣東溶瘤病毒檢測創(chuàng)新服務(wù)