DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt)的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的過程，剛被發(fā)現(xiàn)時(shí)被定義為第五種堿基，實(shí)際上它是一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，在調(diào)控基因表達(dá)、維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因印記、X染色體失活以及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重大的作用，它就像魔術(shù)師手中一頂**神奇的“帽子”，帶給世人層出不窮的驚喜。DNA甲基化的發(fā)生、保持和去除都處在生物體精細(xì)的調(diào)控中，一旦發(fā)生紊亂，對(duì)于動(dòng)物而言將導(dǎo)致胚胎死亡或者**等重大疾病，對(duì)于植物而言將會(huì)出現(xiàn)各種的表型缺陷，那么這頂神奇的“帽子”是如何發(fā)揮它神奇功用的呢？這個(gè)問題成為整個(gè)生物界**熱的研究焦點(diǎn)之一。研究者們從DNA甲基化的發(fā)生機(jī)制，保持機(jī)制到去甲基化機(jī)制，從基因組甲基化狀況研究到特異位點(diǎn)甲基化狀況研究，從**初CpG位點(diǎn)的研究到non-CpG位點(diǎn)的研究，從高甲基化研究到低甲基化、未甲基化研究，以及與其密切相關(guān)的羥甲基化也慢慢進(jìn)入人們的視野，***多角度解析DNA甲基化。在Nature、Science、Cell等**雜志上經(jīng)常能看到它熟悉的身影，說它是生物學(xué)研究的“寵兒”一點(diǎn)都不為過。正所謂“工欲善其事，必先利其器”。 焦磷酸測序能提供基于序列測定的SNP檢測、等位基因頻率分析和甲基化檢測。浙江MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
Hepatic
stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA
methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73. (IF= 14.911)
肝星狀細(xì)胞(HSC)是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞類型。DNA羥甲基化與轉(zhuǎn)錄***有關(guān)，其模式在人類疾病中經(jīng)常發(fā)生改變。研究者采用簡化基因組氧化-亞硫酸鹽測序(RRBS/oxRRBS)檢測靜止和******狀態(tài)的大鼠HSC細(xì)胞的5mC和5hmC水平，證實(shí)了5mC和5hmC在肝纖維化和HSC轉(zhuǎn)分化過程中的整體變化，表明DNA甲基化/羥甲基化是HSC***的關(guān)鍵步驟，可能會(huì)為支持纖維生成的分子事件帶來新的見解，并可能為疾病進(jìn)展提供生物標(biāo)志物以及潛在的新藥物靶點(diǎn)。 上海MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢焦磷酸測序技術(shù)是甲基化檢測新的金標(biāo)準(zhǔn)。
技術(shù)優(yōu)勢
1、ChIP-Seq 能實(shí)現(xiàn)真正的全基因組分析。目前所能獲得的芯片上固定的探針只能**全基因組部分序列，所獲得的雜交信息具有偏向性。
2、對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)分析，ChIP-Seq 通過尋找“峰”，結(jié)合分辨率可精確到10~30 bp，而芯片上探針由于長度所限，無法精確定位，即使目前比較高水平的商業(yè)芯片都無法提供可與ChIP-Seq 媲美的分辨率。
3、是所需樣本數(shù)量。ChIP-chip 需要多達(dá)4~5 μg?的起始樣本，在雜交之前需要進(jìn)行LM-PCR，但可能導(dǎo)致背景增高，競爭性擴(kuò)增等導(dǎo)致假陽性。而ChIP-Seq *需要納克級(jí)起始材料，如SOLiD 起始材料可低至20ng。
安捷倫公司芯片平臺(tái)因其強(qiáng)大的eArray探針設(shè)計(jì)平臺(tái)，可以進(jìn)行芯片的定制。在甲基化領(lǐng)域同樣適用。合作伙伴利用Agilent芯片平臺(tái)設(shè)計(jì)了一款專門針對(duì)**啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化芯片。絕大多數(shù)基因是針對(duì)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島設(shè)計(jì)探針。這款芯片上一共有4160個(gè)功能注釋比較明確的基因，其中2128個(gè)和**發(fā)生有關(guān)系。從功能上分，有256基因和細(xì)胞凋亡有關(guān)，1273個(gè)基因和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，487個(gè)基因和壓力和衰老有關(guān)。采用的是8*60K的芯片格式。利用MeDIP原理進(jìn)行甲基化檢測的方法探針的分辨率可以精確到100 bp。羥甲基化DNA免疫沉淀測序是通過5hmC特異性抗體富集結(jié)合高通量測序技術(shù)。
DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起著動(dòng)態(tài)的重要作用。 借助MethylationEPIC BeadChip，研究人員可以基于單核苷酸分辨率定量檢測基因組中的850,000多個(gè)甲基化位點(diǎn)。包括FFPE在內(nèi)的多重樣本可以并行分析，以便在每樣本比較低成本的情況下實(shí)現(xiàn)高通量功能。依托業(yè)界**的Infinium實(shí)驗(yàn)分析方法，MethylationEPIC BeadChip是全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究(EWAS)的理想之選。它提供了由**精選的***的覆蓋范圍，囊括99%的RefSeq基因，95%的CpG島，高覆蓋度的增強(qiáng)子區(qū)域和其他內(nèi)容類別。由于超過90%的Infinium HumanMethylation450K位點(diǎn)內(nèi)容都涵蓋在內(nèi)，因此新一代MethylationEPIC試劑盒對(duì)這些位點(diǎn)也完全支持。RRBS用于人、哺乳動(dòng)物及魚類方向的高水平甲基化研究。上海單細(xì)胞測序技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
通過甲基化數(shù)據(jù)與耐藥基因Panel數(shù)據(jù)聯(lián)合分析。浙江MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)
這種方法一度被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，將序列與未經(jīng)處理的序列進(jìn)行比較，判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但因?yàn)樯婕暗綔y序，其結(jié)果準(zhǔn)確但要求克隆時(shí)所挑克隆較多，操作繁瑣，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依賴于挑選克隆的數(shù)目，因此這種方法只能算得上是一種半定量的技術(shù)方法。
目前一般會(huì)先用BSP找到甲基化位點(diǎn)，然后根據(jù)甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)MSP引物，進(jìn)行相應(yīng)PCR條件摸索，以用于大量樣本的篩選。 浙江MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)