cfDNABS-Seq送樣要求一、送樣類型分離好的血漿二、保存方式分離后的血漿，用ml離心管分裝，例如：1ml/管；放-20℃冰箱中保存（短暫保存，1-2周）；放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間不能凍融。三、運輸條件干冰運輸：順豐陸運（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰四、抽血要求1、使用Streck**管（不建議使用普通的EDTA-鈉抗凝管），采集10ml外周靜脈血（客戶沒有Streck**管，公司配送）；2、室溫或者放置4℃冰箱中半小時以上，不超過8小時，進行血漿分離步驟五、血漿分離步驟1、4℃條件下以1600g離心10min，離心后將上清（血漿）分裝到2、4℃條件下以16000g離心10min去除殘余細胞，將上清移入新的離心管中，每管分裝1ml;3、血漿樣本存放于-80℃冰箱中保存;使用干冰運輸,提取之前不能凍融。備注1：血漿分離在4℃條件進行，如果客戶沒有冷凍離心機，也可以在室溫條件下進行；備注2：離心后取血漿上清，避免吸取白細胞；通常10ml全血可以獲得4-5ml血漿。 人類基因組有約56M的CpG位點，CpG島約3萬個。四川技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
技術(shù)優(yōu)勢
1、ChIP-Seq 能實現(xiàn)真正的全基因組分析。目前所能獲得的芯片上固定的探針只能**全基因組部分序列，所獲得的雜交信息具有偏向性。
2、對于結(jié)合位點分析，ChIP-Seq 通過尋找“峰”，結(jié)合分辨率可精確到10~30 bp，而芯片上探針由于長度所限，無法精確定位，即使目前比較高水平的商業(yè)芯片都無法提供可與ChIP-Seq 媲美的分辨率。
3、是所需樣本數(shù)量。ChIP-chip 需要多達4~5 μg?的起始樣本，在雜交之前需要進行LM-PCR，但可能導(dǎo)致背景增高，競爭性擴增等導(dǎo)致假陽性。而ChIP-Seq *需要納克級起始材料，如SOLiD 起始材料可低至20ng。 山東850K芯片技術(shù)服務(wù)服務(wù)RRBS用于人、哺乳動物及魚類方向的高水平甲基化研究。
Agilent平臺因為MeDIP技術(shù)本身的特點，都不能到達單堿基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate檢測技術(shù)卻做得到。Illumina的Infinium甲基化檢測技術(shù)來源與前期的SNP檢測，采用的是單堿基延伸的原理。分析利用兩個位點特異的探針檢測這些序列差異的位點，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設(shè)計的，而另一個是為未甲基化位點(U磁珠類型)設(shè)計的。探針的單堿基延伸摻入了一個標(biāo)記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定檢測位點的甲基化水平。Illumina公司早期推出的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點。這款芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有***的應(yīng)用，除了和**相關(guān)的甲基化篩選之外，也能用于其他疾病相關(guān)甲基化檢測。因此對這款產(chǎn)品，研究者給予了很高的評價，目前此產(chǎn)品已停產(chǎn)，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過45萬個甲基化位點，實現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的***覆蓋。此外，還包括CpG島之外的CpG位點，在人類干細胞中鑒定出的非CpG甲基化位點，以及**和正常組織中差異表達的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格。
Hepatic
stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA
methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73. (IF= 14.911)
肝星狀細胞(HSC)是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生和進展的關(guān)鍵細胞類型。DNA羥甲基化與轉(zhuǎn)錄***有關(guān)，其模式在人類疾病中經(jīng)常發(fā)生改變。研究者采用簡化基因組氧化-亞硫酸鹽測序(RRBS/oxRRBS)檢測靜止和******狀態(tài)的大鼠HSC細胞的5mC和5hmC水平，證實了5mC和5hmC在肝纖維化和HSC轉(zhuǎn)分化過程中的整體變化，表明DNA甲基化/羥甲基化是HSC***的關(guān)鍵步驟，可能會為支持纖維生成的分子事件帶來新的見解，并可能為疾病進展提供生物標(biāo)志物以及潛在的新藥物靶點。 全基因組甲基化測序是將重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序技術(shù)相結(jié)合。
全基因組甲基化測序(WholeGenomeBisulfiteSequencing,WGBS)是結(jié)合重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序，對有參考基因組進行全基因組的單堿基分辨率的甲基化檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”方案，***用于人、哺乳動物及農(nóng)林牧漁方向的高水平甲基化研究。WGBS滿足全基因組DNA甲基化圖譜及疾病關(guān)聯(lián)分析、基因調(diào)控分析、疾病的甲基化標(biāo)志物篩選等探索性課題的研究。靈長類早期著床前胚胎發(fā)育中的DNA甲基化重編程研究——(團隊成員發(fā)表).(IF=)靈長類胚胎發(fā)生的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控需要DNA甲基化重編程。我們首先建立了基于轉(zhuǎn)座酶的超微量WGBS測序技術(shù)，詳細研究了獼猴早期著床前胚胎7個階段(Sperm、Oocytes、Zygotes、2-cell、8-cell、Morula和ICM)的DNA甲基化動態(tài)變化過程。******闡明了DNA甲基化動力學(xué)的“盈與虧”階段特征，并通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失實驗表明DNA甲基化影響早期猴胚胎發(fā)育。 cfDNA，cell free DNA，就是血液中游離的自身DNA。四川技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
WGBS和RRBS都是金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù), CNS發(fā)表文章都很多，廣發(fā)被接受。四川技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)
WGBS送樣要求一、送樣類型基因組DNA、細胞、全血、動植物組織、FFPE二、保存方式1、基因組DNA、細胞、全血、動植物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間避免反復(fù)凍融。2、FFPE樣本：室溫保存三、運輸條件1、基因組DNA：冰袋或者干冰運輸；2、細胞、全血、組織樣本：干冰運輸，順豐陸運（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；3、FFPE樣本：室溫運輸。四、樣本量要求1、基因組DNA：常規(guī)WGBS，不少于2ug；微量WGBS，20ng1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA，要加RNA酶，去除RNA污染；3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測濃度，基于OD值的檢測方法，例如NanoDrop,會嚴(yán)重高估濃度。2、細胞樣本：常規(guī)WGBS，不少于5x10*6個細胞；微量WGBS，5000個細胞1）收集貼壁或者懸浮細胞、使用預(yù)冷的1×PBS，洗滌2次，600g離心5分鐘；2）***一次離心后，盡量去除上清PBS，保留細胞沉淀;3、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。4、動植物組織：動物組織，30mg以上;植物組織，不同組織。 四川技術(shù)服務(wù)專業(yè)服務(wù)