本申請涉及轉(zhuǎn)錄組基因測序領(lǐng)域，特別是涉及一種轉(zhuǎn)錄組建庫的方法、試劑和應(yīng)用。背景技術(shù)：：基因組和轉(zhuǎn)錄組測序是生命科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)性工作。由于絕大部分非模式生物缺乏基因組數(shù)據(jù)，全長轉(zhuǎn)錄組測序就變得尤為重要，全長轉(zhuǎn)錄本可以促進這些物種的基因功能、基因表達調(diào)控和進化關(guān)系等多方面的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。當(dāng)前，絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)都是基于第二代高通量測序技術(shù)獲得的。然而，第二代測序技術(shù)測序序列短，短序列拼接無法提供大量的長轉(zhuǎn)錄本并且丟失了可變剪接等重要信息，因而轉(zhuǎn)錄組的從頭測序開始采用pacbio第三代測序技術(shù)。在2013年pacbiorsii推出時，其通量較低，測序成本一直讓科研人員望而止步。到2015年10月，pacbio推出sequel平臺，大幅提升了全長轉(zhuǎn)錄組的測序通量，在通量上是pacbiorsii的5-10倍。鑒于三代測序技術(shù)在科研甚至臨床領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿?，很多公司相繼引入sequel平臺，提供pacbio三代測序的全長轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。目前pacbio三代測序的全長轉(zhuǎn)錄組按照pacbio公司推出的標(biāo)準方案來進行，過程如圖1所示，主要包括兩個方面：cdna的制備和轉(zhuǎn)錄組建庫。其中，cdna的制備包括使用clontech公司的smarterpcrcdnasynthesiskit試劑盒，將rna反轉(zhuǎn)錄生成cdna。全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較好的公司找融享生物。四川真核有參轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)
一、數(shù)據(jù)分析流程二、數(shù)據(jù)分析內(nèi)容1.數(shù)據(jù)預(yù)處理目的：對原始測序數(shù)據(jù)進行一定程度的過濾。原理：根據(jù)測序接頭以及測序質(zhì)量對原始的測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，其中，測序質(zhì)量Q與測序錯誤E之間的關(guān)系如下：結(jié)果：對預(yù)處理后質(zhì)量以及堿基分布統(tǒng)計進行統(tǒng)計：將預(yù)處理后reads進行拼接，得到拼接結(jié)果。原理：應(yīng)用deBruijngraphpath算法對reads進行denovo拼接；對上一步的拼接結(jié)果，再用HamiltonPath算法拼接。結(jié)果：UniGene序列，UniGene統(tǒng)計信息，序列長度分布圖3.數(shù)據(jù)庫注釋目的：對拼接得到的UniGene進行功能注釋原理：通過blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫進行比對結(jié)果：比對結(jié)果表格，物種分布統(tǒng)計和Evalue分布統(tǒng)計：UniGene定量分析。原理：以UniGene為reference，分別將每個樣本的reads進行referencemapping,從而得到每個樣本在每個UniGenes中的一個reads覆蓋度，然后應(yīng)用RPKM/FPKM標(biāo)準化公式對富集片段的數(shù)量進行歸一化。RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:FPKM：FragmentsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:UniGene表達分布圖，1X，5X分別為FPKM=1，F(xiàn)PKM=5分界點，可以大體觀察到低表達。貴州醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炘宿D(zhuǎn)錄組測序找融享生物 結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 SD位點分析、表達差異分析、功能富集等。
轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)飽和度模擬圖 注:橫坐標(biāo)為reads的采樣率，縱坐標(biāo)為RPKM的相對誤差，Q1-4分別展示了低表達到高表達的基因的飽和性: Q1 (0-25%):轉(zhuǎn)錄本表達水平排名位于前25%的基因;Q2 (25-50%): 轉(zhuǎn)錄本表達水平排名位于25-50%的基因;Q3 (50-75%): 轉(zhuǎn)錄本表達水平排名位于50-75%的基因;Q4 (75-100%): 轉(zhuǎn)錄本表達水平排名位于75%以上的基因.SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)是指在基因組上由單個核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富?；诟鳂悠?reads 與參考基因組序列的比對結(jié)果
外顯子捕獲測序和轉(zhuǎn)錄組測序分析有什么不同？外顯子捕獲測序和轉(zhuǎn)錄組測序都是針對基因組上轉(zhuǎn)錄區(qū)域進行測序，但是外顯子捕獲測序針對已有基因組信息的物種，而轉(zhuǎn)錄組分析既能針對已有基因組信息的物種，也能針對沒有基因組信息的新物種，因此，兩者的分析存在一定的差異：分析的目標(biāo)區(qū)域不同。外顯子捕獲測序只針對基因組上已知的編碼區(qū)，而轉(zhuǎn)錄組測序不僅針對基因組上已知的編碼區(qū)，還能夠檢測非編碼RNA等轉(zhuǎn)錄組的信息。得到的結(jié)果不同。外顯子捕獲測序可以得到序列變異的信息，而轉(zhuǎn)錄組測序不僅可以獲得已知序列的變異信息和新的轉(zhuǎn)錄本信息（針對從頭拼接），還可以得到表達譜信息和基因的可變剪接。外顯子捕獲測序的樣品來源是DNA，轉(zhuǎn)錄組測序的樣品來源是RNA。轉(zhuǎn)錄服務(wù)博士團隊專門為您打造屬于您的服務(wù)。
轉(zhuǎn)錄組分析流程將下機數(shù)據(jù)進行過濾得到 Clean Data，與指定的參考基因組進行序列比對，得到的 Mapped Data，進行插入片段的長度檢驗、隨機性檢驗等文庫質(zhì)量評估;進行可變剪接分析、新基因發(fā)掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等結(jié)構(gòu)水平分析;根據(jù)基因在不同樣品或不同樣品組中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因功能注釋和功能富集等表達水平分析。測序質(zhì)量控制在進行數(shù)據(jù)分析之前，首先需要確保這些Reads有足夠高的質(zhì)量，以保證后續(xù)分析的準確。所以要對數(shù)據(jù)進行嚴格的質(zhì)量控制，經(jīng)過一系列的質(zhì)量控制之后得到的高質(zhì)量的Clean Dat。。全基因組測序找上海融享生物科技有限公司。陜西BCR轉(zhuǎn)錄組測序哪家好
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