重慶專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)創(chuàng)新服務(wù)

    ***代測(cè)序技術(shù)1975年由FrederickSanger所提出的鏈終止法以及1977年由WalterGibert所發(fā)明的鏈降解法被稱為***代測(cè)序技術(shù)。1977年，WalterGilbert和FrederickSanger發(fā)明了***臺(tái)測(cè)序儀，并應(yīng)用其測(cè)定了***個(gè)基因組序列，噬菌體X174，全長(zhǎng)5375個(gè)堿基。WalterGilbert和FrederickSanger也因在測(cè)序技術(shù)中的貢獻(xiàn)獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。技術(shù)原理目前，基于***代測(cè)序技術(shù)的測(cè)序儀幾乎都是采用Sanger提出的鏈終止法。鏈終止法測(cè)序的**原理是ddNTP的2'和3'端都不含羥基，因此在合成核酸鏈的過程中無法形成磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致DNA合成反應(yīng)中斷。在測(cè)定待測(cè)核酸片段的序列時(shí)，向反應(yīng)體系中加入一定比例的帶有放射性同位素標(biāo)記的4種ddNTP，利用DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待測(cè)核酸模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止，**終會(huì)得到一組長(zhǎng)度各相差一個(gè)堿基的鏈終止產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可通過高分辨率變性凝膠電泳分離并根據(jù)其長(zhǎng)度排序，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影進(jìn)行檢測(cè)，從而確定目的核酸片段各個(gè)位置的堿基。完整的測(cè)序過程分為4步：：如要利用Sanger測(cè)序方法進(jìn)行完整基因組的測(cè)定，首先要將提取得到的樣品完整DNA打碎，形成DN**段，如只是測(cè)定單個(gè)目的基因的序列。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)病理檢測(cè)平臺(tái)配備有Roche/Leica/Dako等多種全自動(dòng)檢測(cè)儀器，有病理醫(yī)生進(jìn)行精確的判讀。重慶專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)創(chuàng)新服務(wù)

    ，構(gòu)建單鏈DNA測(cè)序文庫。，固體支撐體的每一個(gè)單獨(dú)小空間中只包含一條DNA鏈，之后通過PCR特異性的將模板DNA進(jìn)行富集，從而達(dá)到測(cè)序所需的模板量。，反應(yīng)試劑清洗和成像捕捉，不斷反復(fù)進(jìn)行此三步循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)按順序測(cè)定序列中的一個(gè)堿基。第二代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)第二代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：一次能夠同時(shí)得到大量的序列數(shù)據(jù)，相比于一代測(cè)序技術(shù)，通量提高了成千上萬倍；單條序列成本非常低廉。第二代測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)：序列讀長(zhǎng)較短，Illumina平臺(tái)**長(zhǎng)為250-300bp，454平臺(tái)也只有500bp左右；由于建庫中利用了PCR富集序列，因此有一些含量較少的序列可能無法被大量擴(kuò)增，造成一些信息的丟失，且PCR過程中有一定概率會(huì)引入錯(cuò)配堿基；想要得到準(zhǔn)確和長(zhǎng)度較長(zhǎng)的拼接結(jié)果，需要測(cè)序的覆蓋率較高，導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤較多和成本增加。第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用二代測(cè)序是現(xiàn)階段科研市場(chǎng)的主力平臺(tái)，主要應(yīng)用包括：基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、群體測(cè)序、擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組測(cè)序、重測(cè)序等。由于成本較低，二代測(cè)序在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用也十分***，主要包括：**基因組、遺傳病基因組、**與代謝疾病等。 重慶多基因聯(lián)合檢測(cè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)口碑推薦邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)目前已完成約30+靶點(diǎn)的方法學(xué)驗(yàn)證，50+靶點(diǎn)的方法學(xué)建立。

    RUROLimfinityNGS是適用于二代測(cè)序全流程的信息管理平臺(tái)，包含您提到的樣本前處理、樣本接收、處理、樣本存儲(chǔ)、文庫制備、測(cè)序、完成以及質(zhì)控等全流程信息管理，實(shí)現(xiàn)了真正意義上樣本全生命周期的管理，并且符合21CFRPart11電子簽名的規(guī)定1.不要?jiǎng)h除或篡改試驗(yàn)數(shù)據(jù)2.不隱藏不良的檢驗(yàn)結(jié)果3.了解并符合審查審計(jì)追蹤。每個(gè)反應(yīng)還包含四種雙脫氧核糖核苷酸的混合物，每一種對(duì)應(yīng)一個(gè)DNA堿基。這些雙脫氧核糖核苷酸與DNA單體十分類似，因此可以參與DNA鏈的增長(zhǎng)，但是他們和天然的脫氧核糖核苷酸有兩點(diǎn)不同：（1）他們?nèi)鄙僖粋€(gè)會(huì)影響DNA鏈進(jìn)一步衍生的3’羥基。在DNA延伸過程中，這個(gè)3’羥基一旦加入DNA分子中就會(huì)導(dǎo)致鏈的終止；（2）每個(gè)雙脫氧核糖核苷酸都有獨(dú)特的熒光染料吸附，使得DNA測(cè)序的自動(dòng)檢測(cè)得以進(jìn)行。

    ⑦側(cè)翼序列堿基數(shù)，各部分之間用tab鍵隔開。按照這種格式依次對(duì)68個(gè)基因座進(jìn)行錄入。68個(gè)基因座基因配置文件錄入完成后，運(yùn)行***。該文件給出了①基因座名稱，②基因分型，③擴(kuò)增子堿基數(shù)，④擴(kuò)增子序列信息，⑤測(cè)序深度五個(gè)部分。根據(jù)國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)(internationalsocietyforforensicgenetics，isfg)發(fā)表的關(guān)于y-str基因座的str序列指南()和niststr數(shù)據(jù)庫(strbase.)y染色體str情況說明對(duì)67個(gè)y-str基因座的序列構(gòu)建**重復(fù)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品2800m得到了完整的str分型，完全能夠滿足法醫(yī)str檢驗(yàn)的要求。表3-1注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目。表3-2注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目。二、采用實(shí)施例1制備的試劑盒的應(yīng)用——口腔拭子樣本的基因座分型樣本一、樣本二和樣本三為3名漢族男性無關(guān)個(gè)體的口腔拭子的基因組dna，濃度均為1ng/μl。3名漢族男性均知情同意。將步驟一中的標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液替換為樣本一、樣本二或樣本三，其它步驟均不變。檢測(cè)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，樣本一、樣本二和樣本三均獲得了完整的str分型結(jié)果。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具備從樣本制備到H&E，IHC、FISH、RNAscope及多重免疫組化等全套組織病理和分子病理檢測(cè)能力。

    吸棄上清。f.每孔加入100uL80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。短時(shí)離心，吸棄上清。g.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入30uLNFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。h.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉(zhuǎn)移上清到新的孔板中。實(shí)施例3.多重PCR一、***輪多重PCRa.按照QubitdsDNAHSAssayKit操作手冊(cè)檢測(cè)樣品濃度，根據(jù)Qubit檢測(cè)的樣本濃度，每個(gè)樣品取同樣的量(10ng)，每5～10個(gè)樣本混合在一起轉(zhuǎn)移到新的孔板中。b.***輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個(gè)左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到，多個(gè)引物混成一個(gè)OP引物池做為***輪PCR的上游引物。配置PCR總體系,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時(shí)離心。c.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-1st程序運(yùn)行2個(gè)小時(shí)。二、PCR產(chǎn)物純化，取下孔板，打開蓋子，每孔加入60uL的磁珠，吹打混勻，室溫下孵育5分鐘。b.將孔板或八聯(lián)管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。c.每孔加入100uL80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。d.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入20uLNFW，吹打混勻重懸磁珠。MLH1抗體試劑 蘇蘇械備20180519號(hào).河南定制邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

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    下游的引物IP用于第二輪多重PCR。具體的建庫過程是：步驟1，將樣本DNA進(jìn)行片段化處理，隨后每個(gè)片段兩端加上特殊的接頭；步驟2，加入***輪擴(kuò)增的上游引物混合池，與特殊接頭互補(bǔ)的通用引物，配制成PCR總體系，進(jìn)行***輪擴(kuò)增；步驟3，將***輪PCR產(chǎn)物純化后，加入第二輪擴(kuò)增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補(bǔ)的通用引物配制成PCR總體系，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增；步驟4，將第二輪PCR產(chǎn)物純化后，配置反應(yīng)總體系，進(jìn)行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測(cè)序。上述技術(shù)方案中，作為推薦，步驟2中，***輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個(gè)左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到，多個(gè)引物混成一個(gè)OP引物池做為***輪PCR的上游引物。PCR總體系為：2倍PCRMix35uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL或OP2uL，DNA25uL。上述技術(shù)方案中，作為推薦，步驟3中，第二輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，在其5’端加上測(cè)序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個(gè)左右的堿基，其中根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到的序列長(zhǎng)度是20個(gè)堿基左右，Tm值設(shè)定在60℃，多個(gè)引物混成一個(gè)IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。重慶專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)創(chuàng)新服務(wù)