四川多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺技術(shù)指導(dǎo)

    PacBio平臺技術(shù)關(guān)鍵DNA聚合酶，該技術(shù)得到的序列讀長主要跟DNA聚合酶的活性有關(guān)，它主要受激光對其造成的損傷所影響。熒光基團標(biāo)記在核苷酸3'端磷酸上，在DNA合成過程中，3'端的磷酸鍵隨著DNA鏈的延伸被斷開，標(biāo)記物被棄去，減少了DNA合成的空間位阻，維持DNA鏈連續(xù)合成，延長了測序讀長。ZMW(零模波導(dǎo)孔)，將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強大熒光背景進行區(qū)分，在一個反應(yīng)管中有許多這樣的圓形納米小孔，其外徑*有100nm，激光從底部打出后不能穿透小孔進入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個小范圍里，使得熒光信號*來自這個小反應(yīng)區(qū)域，孔外其它游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實現(xiàn)將背景熒光降到比較低。PacBio平臺技術(shù)優(yōu)勢1.近乎完美的一致性和準(zhǔn)確性三代測序單堿基錯誤率雖然很高，但是這種單堿基的錯誤是隨機發(fā)生的，因此，對同一段序列測序覆蓋多次就能夠進行糾錯，一般覆蓋到10X以上的深度就能達到。2.不存在測序的偏好性因為SMRT技術(shù)在樣本制備時無需PCR擴增，對于某些具有極端的堿基組成的核酸區(qū)域，三代測序也是無偏好性的，同時也不受回文序列的影響。3.序列準(zhǔn)確比對二代測序得到的序列由于長度不夠，在進行比對時，會出現(xiàn)很多錯誤匹配，從而造成假陽性SNP位點。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有全技術(shù)平臺及豐富的伴隨診斷開發(fā)經(jīng)驗，為藥企合作伙伴提供一體化開發(fā)服務(wù)。四川多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺技術(shù)指導(dǎo)

    降低引物的擴增效率，也需要重新設(shè)計并合成引物。3、初次復(fù)合擴增時，各個引物在反應(yīng)體系中的濃度均為μm；之后對引物濃度進行調(diào)整，獲得進行pcr擴增時各個引物的**佳濃度。經(jīng)過上述步驟，獲得引物組合。引物組合由120條引物組成，用于檢測68個基因座。各個基因座的名稱、擴增基因座對應(yīng)的引物名稱和引物的核苷酸序列依次見表1中第1列、第2列和第3列。進行pcr擴增時各個引物的**佳濃度見表1中第5列。表1各個基因座對應(yīng)的引物在hg38人類參考基因組(hg38人類基因組的信息見網(wǎng)址./goldenpath/hg38/bigzips/)中的pcr擴增產(chǎn)物的長度和核苷酸序列詳見表2。各個str基因座的pcr擴增產(chǎn)物的長度范圍分布見圖1。表2三、基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒的制備基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒包括引物混合物；引物混合物由步驟二制備的120條引物混合而成。實施例2、實施例1制備的試劑盒檢測標(biāo)準(zhǔn)品2800m的str分型及其應(yīng)用一、實施例1制備的試劑盒檢測標(biāo)準(zhǔn)品2800m的str分型1、dna樣本準(zhǔn)備取標(biāo)準(zhǔn)品2800m，用超純水稀釋，獲得濃度為1ng/μl的標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液。2、pcr擴增以標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液為模板，采用實施例1步驟三制備的引物混合物進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。河北全平臺邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺服務(wù)至上邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)基于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)及病理學(xué)等綜合性轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)全平臺。

    pcrpurificationkit為德國qiagen公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為y5-28006。。qubittmdsdnahsassaykit為thermofisher公司的產(chǎn)品，貨號為q32854。truseqdnapcr-freehtlibraryprepkit為illumina公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為fc-121-3003。kapalibraryquantificationkit為kapa公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為kk4824。miseqreagentkitv3-600cycles測序試劑為illumina公司的產(chǎn)品，貨號為ms-102-3003。miseqfgx二代測序儀為illumina公司的產(chǎn)品。實施例1、基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒的制備一、68個基因座的篩選本發(fā)明的發(fā)明人通過查閱文獻和現(xiàn)有二代測序str分型產(chǎn)品獲得大量候選的y-str基因座，然后根據(jù)中國人群str群體遺傳多態(tài)性分析結(jié)果，**終篩選獲得68個基因座，包括67個y-str基因座和1個性別決定amelogenin基因座。

    3、主要平臺提供方ABI公司三、二代測序簡介1、Roche454測序:454測序是大規(guī)模平行測序的開始。2003年底，454公司推出了基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)—(GS)。2005年454公司被羅氏診斷公司收購，之后優(yōu)化推出GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。羅森博格博士是該技術(shù)的創(chuàng)始人,也是IonTorrent平臺的創(chuàng)始人。454平臺的突出優(yōu)勢是長讀長(400nt)，但準(zhǔn)確率低，成本高。是高通量測序的過渡。454測序技術(shù)的具體步驟為：（1）構(gòu)建測序文庫。將基因組DNA打碎成300～800個堿基片段后，在兩端加上錨定接頭；（2）PCR擴增。擴增產(chǎn)生成千上萬個拷貝；（3）焦磷酸測序。復(fù)制過程中如果發(fā)生堿基互補配對，就會釋放1個焦磷酸，在一系列酶的催化下，釋放出熒光信號，會被CCD捕獲到。每個堿基反應(yīng)都會捕獲到1個熒光信號，由此一一對應(yīng)，模板的堿基序列由此獲得。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請注明出處。 MSH6抗體試劑 蘇蘇械備20180569號.

    于是，每個反應(yīng)會產(chǎn)生許多不同長度的DN**段，并在模版的任一核苷酸位置上由其中一種雙脫氧核糖核苷酸終止鏈的延伸。反應(yīng)混合物可以通過手動灌膠或自動灌膠到用毛細(xì)管進入測序機器，再根據(jù)DNA分子大小不同用電泳分離DNA。當(dāng)DNA流過凝膠后，DNA序列可以通過雙脫氧核糖核苷酸上發(fā)出的熒光來進行分析。當(dāng)今的Sanger測序儀使用的是毛細(xì)管自動上樣的凝膠電泳，一般可以同時分析8-96個系列反應(yīng)。二代測序系統(tǒng)在十年前就是因其可同時進行大量平行測序反應(yīng)而廣為人知。這些系統(tǒng)可以同時分析百萬甚至上億個序列反應(yīng)。雖然不同的機器生產(chǎn)時會在技術(shù)細(xì)節(jié)上有許多不同，但他們都有以下幾個共同點：1,文庫建立：所有二代測序的平臺都需要一個基因文庫，這個基因文庫包含通過引申或者連接自定義的接頭序列。2,測序儀器：每個文庫片段在共階吸附的DNA連接因子的作用下，以文庫適配序列為模版，在固體表面上進行擴增。這步擴增會產(chǎn)生許多DNA蔟，每個來源于一個文庫片段，每個基因蔟都會像**的測序反應(yīng)一樣起作用。3,數(shù)據(jù)輸出：每個儀器都會在測序結(jié)束后給出原始數(shù)據(jù)。這個原始數(shù)據(jù)時每個基因蔟中形成的DNA序列的**。作者：麗舍咨詢鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)蛋白免疫產(chǎn)品開發(fā)平臺可提供基于IHC平臺的體外診斷試劑盒以及蛋白抗體原料一站式開發(fā)服務(wù)。河南全平臺邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺技術(shù)指導(dǎo)

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)有多年的藥企服務(wù)經(jīng)驗，緊跟藥物研發(fā)趨勢，熟悉新藥研發(fā)動向。四川多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺技術(shù)指導(dǎo)

    thermofisherscientific)等。研究發(fā)現(xiàn)，基于pcr-ce分型時，相同片段長度的等位基因中存在重復(fù)區(qū)域序列結(jié)構(gòu)不一致的情況。二代測序技術(shù)(secondgenerationsequencing，sgs)又稱為下一代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing，ngs)，具有測序通量高、速度快的優(yōu)點。ngs不僅能從長度多態(tài)性上對str基因座進行分析，還能從序列上發(fā)掘str基因座的遺傳多態(tài)性。隨著ngs測序成本越來越低、測序讀長逐漸的增加，ngs對str分型技術(shù)也越來越成熟。近年來，ngs技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)str分型研究。相比于pcr-ce分型，ngs技術(shù)在y-str基因座的分析中具有很多優(yōu)勢：1、樣本輸入量低，使得微量樣本及降解樣本檢材的分型研究變?yōu)榭赡埽?、準(zhǔn)確性高，能夠全部覆蓋基因座的每個堿基并通過產(chǎn)出高測序深度保證y-str基因座各等位基因的高概率精確判斷的嚴(yán)謹(jǐn)性；3、能夠獲得y-str等位基因間的核苷酸差異信息，由于**重復(fù)結(jié)構(gòu)存在差異或擴增區(qū)段內(nèi)存在變異(側(cè)翼序列的堿基突變或插入缺失)，序列長度相等的等位基因可能是具有遺傳穩(wěn)定性的完全不同的等位基因，這種y-str序列多態(tài)性是個體識別分析的寶貴資源；4、成本低，通過對每個樣本檢材添加標(biāo)簽一次可以同時對多個樣本進行平行測序。四川多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺技術(shù)指導(dǎo)