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    圖1為兩輪多重PCR的二代測(cè)序建庫過程。圖2為10個(gè)樣本100SNPs平均覆蓋深度。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例*用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1.基因組DN**段化a.打開Qsonica超聲破碎儀，提前讓循環(huán)水浴降溫，工作溫度為4℃。b.轉(zhuǎn)移總量為1ug的基因組DNA到，用NucleaseFreeWater(以下稱NFW)補(bǔ)足到100uL，震蕩混勻，短時(shí)離心。c.將，旋緊中軸，插入頂蓋，閉合機(jī)器，設(shè)定打斷程序：振幅-25％，on&off為20s-30秒，時(shí)長15分鐘。開始打斷。d.打斷結(jié)束后，取出，按照順序排列整齊，開蓋。實(shí)施例，先配置去除DNA之外的試劑，按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時(shí)離心，分裝到96孔板中，每孔加7uL，之后從前面，蓋上蓋子。震蕩混勻，短時(shí)離心。。設(shè)定程序：25℃30分鐘、72℃15分鐘、4℃保持。c.結(jié)束后，每孔中加入Ligase(單***)和1uL的Adapter，蓋上新的蓋子。震蕩混勻，短時(shí)離心。室溫下孵育20-30分鐘。d.磁珠震蕩30秒，充分混勻后，每一孔中加入25uL的磁珠，蓋上新蓋子。震蕩混勻，短時(shí)離心。室溫下孵育5分鐘。e.將96孔板或八聯(lián)管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為創(chuàng)新藥企開展全球多中心臨床試驗(yàn)研究，提供中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及伴隨診斷開發(fā)服務(wù)。廣東專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    1、Illumina原理：橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像主要步驟：①DNA文庫制備——超聲打斷加接頭②Flowcell——吸附流動(dòng)DN**段③橋式PCR擴(kuò)增與變性——放大信號(hào)④測(cè)序——測(cè)序堿基轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)：Illumina的這種測(cè)序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測(cè)量問題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來源是堿基的替換。而讀長短（200bp-500bp）也讓其應(yīng)用有所局限。2、Roche454油包水PCR+4種dNTP車輪大戰(zhàn)+檢測(cè)焦磷酸水解發(fā)光主要步驟：①DNA文庫制備——噴霧打斷加接頭②乳液PCR——注水入油**PCR③焦磷酸測(cè)序——磁珠入孔，焦磷酸信號(hào)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)：454技術(shù)優(yōu)勢(shì)測(cè)序讀長較長，平均可達(dá)400bp，缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測(cè)量類似于PolyA的情況時(shí)，測(cè)序反應(yīng)會(huì)一次加入多個(gè)T，可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會(huì)在測(cè)序過程中引入插入和缺失的測(cè)序錯(cuò)誤。3、IonTorrent原理油包水PCR+4種dNTP車輪大戰(zhàn)+微電極PH檢測(cè)主要步驟：①DNA文庫制備——噴霧打斷加接頭②乳液PCR——注水入油**PCR③微電極pH檢測(cè)——磁珠入池記錄pH優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)：IonTorrent與454相比，主要差異在測(cè)序中，IonTorrent不需要昂貴的物理成像設(shè)備，成本相對(duì)較低體積較小。遼寧個(gè)性化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)針對(duì)藥物研發(fā)過程中靶點(diǎn)、適應(yīng)癥及PD研究中生物標(biāo)志物等研究的進(jìn)行方案開發(fā)設(shè)計(jì)。

    成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）在多種惡性**中存在異常***，并與**的發(fā)***展密切相關(guān)，已成為目前“不限*種”的熱點(diǎn)研究靶標(biāo)之一。至今已有4款靶向FGFR的抑制劑上市：國際***FDA批準(zhǔn)的泛FGFR抑制劑為強(qiáng)生的Balversa（Erdafitinib），同時(shí)獲批的伴隨診斷為QIAGENE基于PCR方法的FGFR2/3異常檢測(cè)；2020年獲批的Incyte公司的Pemigatinib為較早膽管*靶向藥物，其伴隨診斷為FoundationMedicine的FoundationOneCDxNGSpanel，檢測(cè)FGFR2融合或重排；2021年,又有連續(xù)兩個(gè)藥物Futibatinib和Infigratinib獲批，***攜帶FGFR2融合或重排的局部晚期或轉(zhuǎn)移性膽管*患者。伴隨診斷和生物標(biāo)志物的開發(fā)和驗(yàn)證，已成為患者分層/富集及藥物上市的“標(biāo)配”。基于綜合性轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究平臺(tái)，邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究針對(duì)FGFR抑制劑的藥物臨床研究提供從生物標(biāo)志物檢測(cè)到伴隨診斷產(chǎn)品開發(fā)的完整解決方案。

panFGFxpanel的優(yōu)勢(shì)在于：針對(duì)性強(qiáng)——panel“小而精”，集中研究FGFR及上下游信號(hào)通路關(guān)鍵基因；應(yīng)用性廣——panel小，成本低；搭配酶切建庫法、快速雜交法，縮短TAT；靈活性強(qiáng)——探針可實(shí)現(xiàn)物理上模塊區(qū)分，隨時(shí)滿足伴隨診斷產(chǎn)品開發(fā)需求。??方案3：IHC法檢測(cè)FGF-19過表達(dá)當(dāng)前針對(duì)肝*及乳腺*的FGFR4抑制劑開發(fā)速度很快，多個(gè)藥物進(jìn)入臨床II期的研究。FGFR4-FGF19信號(hào)通路在肝細(xì)胞*（HCC）的發(fā)***展過程中發(fā)揮重要的作用。有研究顯示，在骨骼肌中過表達(dá)FGF19的轉(zhuǎn)基因小鼠在其生命早期會(huì)發(fā)生多發(fā)性HCC，而其他組織則不會(huì)受到影響，初步推斷FGF19通過***FGFR4增加肝細(xì)胞增殖而誘導(dǎo)肝*（圖6）。

圖6高表達(dá)FGF19-FGFR4靶向晚期肝*[10]FGFR4高選擇性抑制劑在FGF-19過表達(dá)的HCC荷瘤小鼠病理模型上呈現(xiàn)了***的抗**藥效。FGF-19擴(kuò)增和過表達(dá)有望成為FGFR4選擇性抑制劑***HCC的重要生物標(biāo)志物。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的病理平臺(tái)已經(jīng)建立并系統(tǒng)驗(yàn)證了FGF-19IHC檢測(cè)方法，迄今已為國內(nèi)眾多創(chuàng)新藥企的臨床研究提供了檢測(cè)支持服務(wù)（圖7）。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為全球合作伙伴提供包括生物標(biāo)記物挖掘、藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證、伴隨診斷開發(fā)等一體化解決方案。

    2、IlluminaSolexa測(cè)序方法：由Solexa公司開發(fā)，2006年發(fā)布，于2007年被Illumina收購，并將測(cè)序儀命名商品化為IlluminaGenomeAnalyzer（簡(jiǎn)稱GA）；Illumina不斷升級(jí)GA，特別是HiSeq系列測(cè)序儀的研發(fā)完成，由此打破了***的“摩爾定律”?；玖鞒蹋海?）構(gòu)建測(cè)序文庫。提取基因組DNA，隨機(jī)打斷成100-200bp片段，末端加上接頭；（2）橋式擴(kuò)增。解鏈后的單鏈DN**段兩端被分別固定于芯片上，形成橋狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增。經(jīng)過PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生數(shù)百萬條待測(cè)的DN**段，隨后被線性化；（3）測(cè)序。將熒光標(biāo)記的dNTP、聚合酶、引物加入到測(cè)序通道啟動(dòng)測(cè)序循環(huán)。DNA合成時(shí)，伴隨著堿基的加入會(huì)有焦磷酸被釋放，從而發(fā)出熒光，不同堿基用不同熒光標(biāo)記，讀取到核苷酸發(fā)出的熒光后，將3羥基末端切割，隨后加入第2個(gè)核苷酸，重復(fù)***個(gè)核苷酸的步驟，直到模板序列全部被合成雙鏈DNA。Illumina現(xiàn)有二代測(cè)序平臺(tái)：MiSeq、HiSeq2500(1000G)、HiSeq3000、HiSeq4000、NextSeq500、HiSeqX10(10臺(tái)HiSeq2500并行)、HiSeqXFive。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具備從樣本制備到H&E，IHC、FISH、RNAscope及多重免疫組化等全套組織病理和分子病理檢測(cè)能力。浙江個(gè)性化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)技術(shù)指導(dǎo)

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有豐富的伴隨診斷開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，高質(zhì)量的管理體系和高素質(zhì)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)。廣東專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    第三代測(cè)序技術(shù)以PacBio公司的SMRT技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔單分子技術(shù)為**的新一代測(cè)序技術(shù)被稱為第三代測(cè)序技術(shù)，與前兩代測(cè)序技術(shù)相比，其比較大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且理論上可以測(cè)定無限長度的核酸序列。PacBio技術(shù)平臺(tái)SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片，將DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部。熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)，當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類，從而獲得核酸的堿基序列信息。ZMW孔PacBio平臺(tái)測(cè)序原理每個(gè)ZWM孔只允許一條DNA模板進(jìn)入，DNA模板進(jìn)入后，DNA聚合酶與模板結(jié)合，加入4種不同顏色熒光標(biāo)記4種dNTP，其通過布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)進(jìn)入檢測(cè)區(qū)域并與聚合酶結(jié)合從而延伸模板，與模板匹配的堿基生成化學(xué)鍵的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于其他堿基停留的時(shí)間，因此統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)存在時(shí)間的長短，可區(qū)分匹配的堿基與游離堿基。通過統(tǒng)計(jì)4種熒光信號(hào)與時(shí)間的關(guān)系，即可測(cè)定DNA模板序列。 廣東專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦