天津作用dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

    5MSI在結(jié)直腸ai診斷及預(yù)后中的應(yīng)用MSI在林奇綜合征中篩查診斷中的應(yīng)用由于如Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)、Bethesda標(biāo)準(zhǔn)等鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)林奇綜合征診斷缺乏穩(wěn)定性和敏感性[9]，目前公認(rèn)的**準(zhǔn)確、可靠地診斷林奇綜合征的方法是MMR基因測(cè)序。又因MMR基因測(cè)序的費(fèi)用昂貴，因此在進(jìn)行基因測(cè)序前先進(jìn)行初步篩查。目前較為公認(rèn)的林奇綜合征相關(guān)的初步篩查檢測(cè)包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和免疫組化（IHC）。當(dāng)樣本確定為MSS時(shí)，患者不可能患林奇綜合征；當(dāng)樣本確定為MSI-L時(shí)，絕大部分患者不可能患林奇綜合征；當(dāng)樣本確定為MSI-H時(shí)，患者患有林奇綜合征的可能性極高，需進(jìn)一步進(jìn)行林奇綜合征的篩查診斷。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：PCR的結(jié)果判讀本文不做討論。IHC檢測(cè)注意事項(xiàng)：（1）可能會(huì)出現(xiàn)MMR蛋白在liu細(xì)胞核著色不完整或著色極微弱（并伴隨細(xì)胞質(zhì)著色）現(xiàn)象，有文獻(xiàn)指出該現(xiàn)象可能是MMR基因突變（如錯(cuò)義突變）或MMR蛋白特點(diǎn)（該現(xiàn)象常見于MSH6蛋白）而造成的，建議進(jìn)行PCR檢測(cè)。（2）大約有ai患者其IHC檢測(cè)MLH1蛋白表達(dá)缺失。這種缺失同遺傳性無關(guān)，是MLH1啟動(dòng)子雙等位基因的異常甲基化而造成的，為避免誤診，需加做BRAFV600E突變檢測(cè)。若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，可排除Lynch綜合征[10]。。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)已基于客戶需求建立了完整的病理學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，可提供一站式病理學(xué)解決方案。天津作用dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

    這種類型占Lynch綜合征的絕大多數(shù)，以MLH1、MSH2、MSH6和PMS2胚系突變?yōu)橹?，突變率分別為32％、38％、14％和15％，攜帶后兩者與前兩者相比ai癥發(fā)生率低、發(fā)病年齡較大。(2)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM，又稱liu相關(guān)鈣離子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)1)基因雜合性胚系缺失。近年的研究發(fā)現(xiàn)，MSH2表達(dá)丟失的Lynch綜合征患者中，約5％是因位于MSH2上游的EpCAM基因3’端外顯子胚系缺失而引起的MSH2表觀遺傳學(xué)沉默，EpCAM胚系缺失的攜帶者發(fā)生結(jié)直腸ai的危險(xiǎn)性與MSH2突變攜帶者相似，高于MSH6突變攜帶者。(3)MLH1基因啟動(dòng)子胚系甲基化。有報(bào)道少數(shù)Lynch綜合征家系的MLH1基因本身并未發(fā)生突變，而是因MLH1的啟動(dòng)子發(fā)生胚系甲基化而導(dǎo)致的MLH1表觀沉默，但攜帶此類突變的家系的外顯率尚待明確。與Lynch綜合征不同的是，多數(shù)散發(fā)性MSI-H結(jié)直腸ai并不是由錯(cuò)配修復(fù)基因體細(xì)胞突變導(dǎo)致的，而是因MLH1基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致MLH1基因發(fā)生表觀遺傳學(xué)沉默所致。當(dāng)2個(gè)等位基因的MLH1啟動(dòng)子區(qū)CpG島均發(fā)生甲基化時(shí)，MLH1基因失活，蛋白失表達(dá)，由此導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)功能異常所發(fā)生的liu與Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸ai相似，均為MSI-Hliu。近期一項(xiàng)大宗的文獻(xiàn)薈萃分析結(jié)果顯示。黑龍江標(biāo)準(zhǔn)dMMR抗體檢測(cè)試劑經(jīng)驗(yàn)豐富邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具備從樣本制備到H&E，IHC、FISH、RNAscope及多重免疫組化等全套組織病理和分子病理檢測(cè)能力。

    MSH2和MLH1分別與其同源錯(cuò)配修復(fù)蛋白組成復(fù)合體發(fā)揮作用。MSH2分別與MSH6、MSH3組成復(fù)合體MutSα、MutSβ。MLH1則分別與PMS2、PMS1或MLH3形成復(fù)合體MutLα、MutLβ或MutLγ。MutSα或MutSβ識(shí)別了錯(cuò)配堿基后，與DNA堿基結(jié)合，再與MutL結(jié)合，***ATP酶，水解錯(cuò)配的堿基，同時(shí)***核酸內(nèi)切酶1，切除并修復(fù)錯(cuò)配的堿基。微衛(wèi)星(microsatellite)***存在于原核及真核生物基因組中，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，但在錯(cuò)配修復(fù)基因功能發(fā)生異常時(shí)，子代細(xì)胞微衛(wèi)星的重復(fù)核苷酸數(shù)量可增多或減少，導(dǎo)致微衛(wèi)星的長(zhǎng)度不再保持一致，這種現(xiàn)象稱MSI。錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生突變或啟動(dòng)子甲基化可引起DNA錯(cuò)配修復(fù)功能的降低，導(dǎo)致MSI。很多重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)基因如Ⅱ型TGF-β、IGF2R、PTEN、BAX等的編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)含有微衛(wèi)星，錯(cuò)配修復(fù)異常導(dǎo)致的MSI可引起這些基因在復(fù)制過程中發(fā)生錯(cuò)義突變或移碼突變，這種復(fù)制錯(cuò)誤不斷累積，**終造成liu的發(fā)生，而MSI則可作為經(jīng)此途徑發(fā)生的結(jié)直腸ai的分子標(biāo)志物。人類基因組中的微衛(wèi)星位點(diǎn)很多，1998年MSI國(guó)際研究合作組織推薦對(duì)Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定的數(shù)量將結(jié)直腸ai分為高頻MSI(MSI-H。

dMMR 是 MMR 表達(dá)缺失，pMMR 是 MMR 表達(dá)正常。dMMR 表現(xiàn)為高頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）， pMMR 表現(xiàn)為低頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）或微衛(wèi)星穩(wěn)定（MS-S）。 目前，*常用的篩查結(jié)直腸ai MMR 表達(dá)有無缺失的方法有 2 種：免疫組化檢測(cè) MMR 相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及 PCR 檢測(cè)多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)以判斷有否存在 MSI。

下面重點(diǎn)來了： 免疫組化：有缺失，dMMR；無缺失，pMMR 免疫組化主要檢測(cè)ai組織中 MLH1，PMS2，MSH2 及 MSH6 這 4 種蛋白的表達(dá)： 

1. 若結(jié)果顯示任一蛋白完全缺失，則判讀為  dMMR； 

2. 若顯示無蛋白缺失，則判度為 pMMR。 所以回到上面的病例： MLH1，PMS2，MSH2 及 MSH6 蛋白均未缺失，應(yīng)判讀為 pMMR，可以用單藥 5-Fu 進(jìn)行輔助化療。 PCR 檢測(cè)：≥40%，MSI-H；<40%，MSI-L/MS-S MSI 的分類是基于不同單核或雙核苷酸重復(fù)序列的改變（如： BAT25、 BAT26、 D5S346、 D2S123 和 D17S250，即 Bethesda 標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星位點(diǎn)）。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)針對(duì)藥物研發(fā)過程中靶點(diǎn)、適應(yīng)癥及PD研究中生物標(biāo)志物等研究的進(jìn)行方案開發(fā)設(shè)計(jì)。

    篩選出分泌特定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株abm58060-20a2-pu。將此細(xì)胞株轉(zhuǎn)入t-75培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期保種或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3腹水誘生法制備單克隆抗體一、腹水制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計(jì)數(shù)～5×105，1ml。懸浮的細(xì)胞腹腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水。取出的腹水于4℃離心4000rpm，10min。小心吸出中間的腹水收集于離心管中，4℃或-20℃保存。二、單克隆抗體的純化用hitraprproteinaff(ge公司)親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。sds-page膠鑒定純度，bradford法測(cè)定濃度。純化的抗體保存于-20℃。實(shí)施例4單克隆抗體特性鑒定一、亞型鑒定用100mmpbs()稀釋包被羊抗鼠igg(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)至μg/ml,每孔加100μl，4℃，過夜。傾空液體，用含％tween的pbs(pbs-t)洗3次，每孔加入200μl封閉液(含2％bsa和3％蔗糖的pbs)，37℃孵育1h。傾空液體，用pbs-t清洗3次。每孔加入，37℃孵育1h。傾空液體用pbs-t清洗3次。用封閉液1：1000稀釋hrp標(biāo)記的羊抗鼠(κ,λ)抗體或1：2000稀釋hrp標(biāo)記的羊抗鼠(igm，igg1，igg2b，igg2b，igg3，iga)抗體，37℃孵育1h。傾空液體，用pbs-t清洗3次。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有豐富的伴隨診斷開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，高質(zhì)量的管理體系和高素質(zhì)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)。浙江提供dMMR抗體檢測(cè)試劑誠(chéng)信合作

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)開發(fā)的伴隨診斷試劑盒,基因突變檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)范圍全。天津作用dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)

    選擇靠近n末端的氨基酸區(qū)域1-100位氨基酸序列與gst蛋白融合表達(dá)為抗原片段，抗原片段的dna編碼序列為seqid**。二.重組msh6蛋白片段的表達(dá)和純化將seqid**的dna序列直接合成并克隆進(jìn)克隆載體質(zhì)粒puc57(南京金斯瑞生物科技有限公司)。該dn**段5’端和3’端分別帶有ecori和xhoi酶切位點(diǎn)，取5μl(約1微克)帶有msh6片段的質(zhì)粒puc57-msh6和用作載體的pet30a-gst(merck)5μl(約1微克)分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：ecori(takara)1μl，xhoi(takara)1μl，5μl10×bufferh，38μlddh2o，37℃酶切三小時(shí)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳，柱離心式dna回收試劑盒(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)切膠回收基因和載體片段。取2μl回收的線性化載體，3μl酶切回收的msh6基因片段，5μl2×ez-ligt4dna快連試劑(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)，混勻，室溫連接三十分鐘。取出-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞(bl21)，解凍后加入連接產(chǎn)物，冰上放置30min。42℃熱激90秒后冰浴2min后，加入800μl無抗性的lb培養(yǎng)基。37℃復(fù)蘇培養(yǎng)20min，涂板。從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到，37℃，200rpm培養(yǎng)，dna測(cè)序(北京華大基因)。將測(cè)序正確的克隆菌液2ul活化的菌液到5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)。天津作用dMMR抗體檢測(cè)試劑技術(shù)指導(dǎo)