湖南作用溶瘤病毒檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)

    所述zhong劉類***培養(yǎng)液的用量可以為2000-3000μl。下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本公開，但是本公開并不因此而受到任何限制。本公開實(shí)施例所涉及的原料、試劑、儀器和設(shè)備，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可通過(guò)購(gòu)買獲得。在本公開實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)溫度時(shí)，實(shí)驗(yàn)溫度均為室溫(20-25℃)。本公開實(shí)施例中使用的試劑來(lái)源如下：dmem/f12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)hyclone公司；cosmo溫敏性水凝膠購(gòu)于日本cosmobio公司；胎牛血清蛋白(fetalbovineserumfbs)購(gòu)于內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；膠原蛋白水解酶(collagenase)購(gòu)于美國(guó)sigma--aldrich。本公開實(shí)施例中使用的zhong劉類細(xì)胞培養(yǎng)液為自主配置，包括：dmem/f12培養(yǎng)基和1％的glutamax(gibco，35050061)、10mm的hepes(gibco，15630080)、10nm的gastrin(sigma，g9145)、10mm的nicotinamide(sigma，n06365)、500ng/ml的a83-01(tocris，2939)、100ng/ml的noggin(peprotech，120-10c)、1mm的n-acetylcysteine(sigma，a9165)，100μg/ml的青鏈霉素、50ng/ml的egf(peprotech，af-100-15)和(sigma，9048-46-8)等生長(zhǎng)因子。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有專業(yè)的病理醫(yī)生提供相應(yīng)的閱片或遠(yuǎn)程病理閱片服務(wù)。湖南作用溶瘤病毒檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)

    實(shí)施例1、培養(yǎng)zhong劉類***將新取出的肺aizhong劉穿刺組織或手術(shù)組織樣本保存于zhong劉類***培養(yǎng)液中，并于48小時(shí)內(nèi)4度冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。除去zhong劉類***培養(yǎng)液，將樣本置于6cm培養(yǎng)皿中；配置含有2％fbs、2mg/ml膠原蛋白水解酶的dmem/f12培養(yǎng)基作為酶解液，酶解液經(jīng)過(guò)濾除菌且37℃溫浴后，加入放置有樣本的培養(yǎng)皿中，其中，1g樣本對(duì)應(yīng)加入8ml酶解液；用消毒滅菌后的剪刀將樣本組織塊剪碎至肉糜狀，并用10ml移液管將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至24孔板中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱酶解2h，酶解過(guò)程中每隔30分鐘使用移液器吹打酶解組織，促進(jìn)酶解效果；之后，將酶解后的混合液放入細(xì)胞研磨篩中，加入酶解液進(jìn)行二次研磨酶解，充分研磨后收集濾液，并將酶解液于300g的離心條件下離心3min，棄上清，沉淀加入10mlzhong劉類***培養(yǎng)液重懸，得到zhong劉細(xì)胞。將細(xì)胞數(shù)量為20000的zhong劉細(xì)胞種植到每孔含有40μlcosmo溫敏性水凝膠的96孔板中，每孔加入150μlzhong劉類***培養(yǎng)液，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每3天更換培養(yǎng)基，直至顯微鏡下觀察到直徑大于aizhong劉類***。吉林標(biāo)準(zhǔn)溶瘤病毒檢測(cè)創(chuàng)新服務(wù)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)基于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)及病理學(xué)等綜合性轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)全平臺(tái)。

    使用肺*經(jīng)2d培養(yǎng)的a549細(xì)胞系替換步驟2中的肺***類***，并以正常胚肺成纖維細(xì)胞系mrc-5作為陰性對(duì)照，放入培養(yǎng)箱中與培養(yǎng)24小時(shí)后，使用(將新城疫病毒ndv溶瘤病毒作為待測(cè)溶瘤病毒，將腺病毒prostatak溶瘤病毒作為參比溶瘤病毒)***，檢測(cè)溶瘤病毒對(duì)**細(xì)胞的殺傷率。檢測(cè)結(jié)果見表2。對(duì)比例3按照實(shí)施例中步驟3的方法進(jìn)行培養(yǎng)，不同的是，使用肺*經(jīng)2d培養(yǎng)的a549細(xì)胞系替換步驟2中的肺***類***，并以正常胚肺成纖維細(xì)胞系mrc-5作為陰性對(duì)照，放入培養(yǎng)箱中與培養(yǎng)24小時(shí)后，使用(將新城疫病毒ndv溶瘤病毒作為待測(cè)溶瘤病毒，將腺病毒prostatak溶瘤病毒作為參比溶瘤病毒)***，檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2和γ-干擾素的濃度，并計(jì)算溶瘤病毒的細(xì)胞因子促表達(dá)能力。檢測(cè)結(jié)果見表3。表1由表1可以看出，ndv溶瘤病毒及prostatak溶瘤病毒在a549細(xì)胞系和肺*類***中均可以復(fù)制擴(kuò)增，但是ndv溶瘤病毒及prostatak溶瘤病毒在肺*類***中的復(fù)制水平均弱于其在a549細(xì)胞系中的復(fù)制水平，說(shuō)明肺*類***具有的**微環(huán)境能夠影響溶瘤病毒在**細(xì)胞中的復(fù)制。肺*類***中，ndv溶瘤病毒復(fù)制能力弱于prostatak溶瘤病毒；a549細(xì)胞系中，ndv溶瘤病毒復(fù)制能力優(yōu)于prostatak溶瘤病毒。表2由表2可以看出。

    溫敏性水凝膠的用量為500-1000μl，**類***培養(yǎng)液的用量為2000-3000μl；將**類***與溶瘤病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，溶瘤病毒的用量為；步驟b中還包括將**類***進(jìn)行第二預(yù)培養(yǎng)的步驟，然后再將第二預(yù)培養(yǎng)后的**類***與溶瘤病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)；所述第二預(yù)培養(yǎng)包括：將**類***與溫敏性水凝膠、**類***培養(yǎng)液混合，培養(yǎng)12-96h，其中，相對(duì)于300-1000個(gè)**類***中的**細(xì)胞，溫敏性水凝膠的用量為30-80μl，**類***培養(yǎng)液的用量為100-150μl；將**類***與溶瘤病毒進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，溶瘤病毒的用量為；步驟c中，所述將溶瘤病毒、免疫細(xì)胞和**類***混合培養(yǎng)，包括：c1、將含有免疫細(xì)胞和**類***的細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)皿中，加入**類***培養(yǎng)液培養(yǎng)2-8h，得到混合培養(yǎng)液，其中所述細(xì)胞懸液中免疫細(xì)胞和**細(xì)胞的濃度為×107個(gè)/ml，免疫細(xì)胞：**類***細(xì)胞＝(2-8)：1，相對(duì)于，所述**類***培養(yǎng)液的用量為2-3ml；c2、將所述混合培養(yǎng)液與溶瘤病毒混合培養(yǎng)3-5h，所述溶瘤病毒的用量為1-100moi?？蛇x地，步驟a中，所述檢測(cè)所述***培養(yǎng)物中的溶瘤病毒的復(fù)制水平，包括：a1、獲取所述***培養(yǎng)物中的溶瘤病毒，得到待測(cè)病毒；a2、將所述待測(cè)病毒與所述溶瘤病毒的宿主細(xì)胞混合培養(yǎng)12-96h。邁杰擁有StarLIMS實(shí)驗(yàn)室信息化管理系統(tǒng)，中心實(shí)驗(yàn)室獲得了中國(guó)CNAS ISO 17025實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、美國(guó)CAP認(rèn)證。

    該方法包括：a、將溶瘤病毒與**類***混合培養(yǎng)12-96h，得到***培養(yǎng)物，檢測(cè)所述***培養(yǎng)物中的溶瘤病毒的復(fù)制水平；b、將所述溶瘤病毒與**類***混合培養(yǎng)12-96h，得到第二培養(yǎng)物，檢測(cè)所述第二培養(yǎng)物中溶瘤病毒對(duì)**細(xì)胞的殺傷率；c、將所述溶瘤病毒、免疫細(xì)胞和**類***混合培養(yǎng)2-8h，得到第三培養(yǎng)物，檢測(cè)所述第三培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子水平并計(jì)算所述溶瘤病毒的細(xì)胞因子促表達(dá)能力，所述細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2和/或γ-干擾素；如果待測(cè)溶瘤病毒的復(fù)制水平、對(duì)**細(xì)胞的殺傷率和細(xì)胞因子促表達(dá)能力均高于參比溶瘤病毒，則指示所述待測(cè)溶瘤病毒的有效性高于所述參比溶瘤病毒。本公開的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的溶瘤病毒有效性檢測(cè)方法檢測(cè)得到的溶瘤病毒有效性數(shù)據(jù)與臨床研究階段得到的溶瘤病毒有效性數(shù)據(jù)存在較大差異的可能原因在于：現(xiàn)有的溶瘤病毒有效性檢測(cè)方法中采用的**細(xì)胞模型無(wú)法真實(shí)模擬患者體內(nèi)的**組織的生物學(xué)特性，導(dǎo)致現(xiàn)有的溶瘤病毒有效性檢測(cè)過(guò)程無(wú)法真實(shí)模擬溶瘤病毒在患者體內(nèi)的作用過(guò)程，例如，現(xiàn)有溶瘤病毒有效性檢測(cè)方法中采用的由**細(xì)胞經(jīng)2d培養(yǎng)得到的單層細(xì)胞系，其無(wú)法體現(xiàn)**異質(zhì)性，也無(wú)法模擬患者體內(nèi)的微環(huán)境，而且隨著常規(guī)**細(xì)胞系傳代代次的增加。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具有多年伴隨診斷服務(wù)經(jīng)驗(yàn),獲得CNAS國(guó)際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可,美國(guó)CAP認(rèn)證。吉林標(biāo)準(zhǔn)溶瘤病毒檢測(cè)創(chuàng)新服務(wù)

經(jīng)多平臺(tái)平行驗(yàn)證（MSI-PCR、MSI-NGS)，一致性高，特異性好.湖南作用溶瘤病毒檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)

    其包括將***個(gè)方面中的溶瘤病毒或第三個(gè)方面中的藥物組合物施予有需要的對(duì)象，推薦的，所述增生性疾病是*癥，例如前列腺*、乳腺*、結(jié)直腸*、肺*、肝*、黑色素瘤、淋巴*、胃*、食管*、卵巢*、頭頸部鱗*、膀胱*、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸*或者腎*。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中通過(guò)靜脈內(nèi)、霧化吸入、灌注或者瘤內(nèi)途徑向所述對(duì)象施用約108至1012vp(例如×1010vp)的所述溶瘤病毒，施用次數(shù)1-6次(例如1次、2次、3次、4次、5次或6次)，所述施用可以是每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天進(jìn)行；或者是1天內(nèi)施用1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。本發(fā)明所提供的溶瘤病毒，具有良好的安全性以及體內(nèi)和體外抑瘤效果，抑瘤效果***優(yōu)于現(xiàn)有臨床用藥索拉菲尼和吉西他濱，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1顯示了具有不同結(jié)構(gòu)的重組病毒構(gòu)建示意圖。圖2顯示了具有不同結(jié)構(gòu)的重組溶瘤腺病毒對(duì)**細(xì)胞的抑制效果比較，其中圖2a和2b分別顯示了復(fù)制型和非復(fù)制型對(duì)肝*細(xì)胞系huh-7和腸*細(xì)胞系sw620的抑制效果比較；圖2c和d分別顯示了是否攜帶干擾素序列的溶瘤病毒對(duì)乳腺*細(xì)胞系mda-mb-231和肺*細(xì)胞系hcc827的抑制效果比較；圖2e顯示了重組溶瘤腺病毒對(duì)hlf細(xì)胞的殺傷作用。湖南作用溶瘤病毒檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)