江蘇多組學(xué)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富

    第三代測(cè)序技術(shù)以PacBio公司的SMRT技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔單分子技術(shù)為**的新一代測(cè)序技術(shù)被稱為第三代測(cè)序技術(shù)，與前兩代測(cè)序技術(shù)相比，其比較大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且理論上可以測(cè)定無(wú)限長(zhǎng)度的核酸序列。PacBio技術(shù)平臺(tái)SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片，將DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部。熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)，當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類，從而獲得核酸的堿基序列信息。ZMW孔PacBio平臺(tái)測(cè)序原理每個(gè)ZWM孔只允許一條DNA模板進(jìn)入，DNA模板進(jìn)入后，DNA聚合酶與模板結(jié)合，加入4種不同顏色熒光標(biāo)記4種dNTP，其通過布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)進(jìn)入檢測(cè)區(qū)域并與聚合酶結(jié)合從而延伸模板，與模板匹配的堿基生成化學(xué)鍵的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于其他堿基停留的時(shí)間，因此統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)存在時(shí)間的長(zhǎng)短，可區(qū)分匹配的堿基與游離堿基。通過統(tǒng)計(jì)4種熒光信號(hào)與時(shí)間的關(guān)系，即可測(cè)定DNA模板序列。 邁杰擁有StarLIMS實(shí)驗(yàn)室信息化管理系統(tǒng)，中心實(shí)驗(yàn)室獲得了中國(guó)CNAS ISO 17025實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、美國(guó)CAP認(rèn)證。江蘇多組學(xué)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富

    二、一代測(cè)序簡(jiǎn)介1、發(fā)生和發(fā)展***代測(cè)序技術(shù)是Sanger于20世紀(jì)70年代中末期發(fā)明的雙脫氧鏈終止測(cè)序法，手動(dòng)測(cè)序，用同位素標(biāo)記，Sanger也因此獲得其第2個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)（在Sanger發(fā)明雙脫氧鏈終止測(cè)序法前WalterGilbert發(fā)明化學(xué)降解法測(cè)定DNA序列）；80年代出現(xiàn)***臺(tái)自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備，熒光標(biāo)記代替同位素，計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別；90年代中期測(cè)序儀重大改進(jìn)，毛細(xì)管電泳替代凝膠電泳；2003年完成人類基因組測(cè)序工作。2、基本原理以單條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)鏈，在DNA復(fù)制過程中，合成原料（2’脫氧核苷酸dNTP）中摻入標(biāo)記過的2’3’ddNTP（雙脫氧鏈終止測(cè)序法由此而來(lái)），就會(huì)產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長(zhǎng)度分辨。不同末端終止DNA鏈的長(zhǎng)度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置的ddNTP決定的。經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以得到一系列長(zhǎng)度不同的產(chǎn)物，由于ddNTP帶有熒光標(biāo)記，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，并用相應(yīng)的儀器進(jìn)行檢測(cè)，就可以讀出模板的序列。鏈終止法反應(yīng)的**仍是PCR法。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。 河北提供邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)鄭重承諾邁杰基于基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)及病理組學(xué)等綜合性轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺(tái)，豐富的伴隨診斷開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。

02FGFR通路的異常調(diào)控FGF/FGFR通路的異常調(diào)控由多種因素介導(dǎo)，包括：基因改變（擴(kuò)增、突變和染色體易位）；自分泌和旁分泌信號(hào)；血管生成以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成，并推動(dòng)**的發(fā)***展、侵襲、轉(zhuǎn)移等（圖2），其中主要的三種調(diào)控途徑為：a.FGFR基因擴(kuò)增導(dǎo)致的蛋白過表達(dá)；b.***性突變,該突變通常會(huì)導(dǎo)致配體親和力的提高或受體二聚化的增加及活化（配體不存在的情況下），或激酶結(jié)構(gòu)域的組成性***；c.由染色體易位導(dǎo)致的基因融合。圖2FGFR異常調(diào)控的致*機(jī)制[5]圖2FGFR異常調(diào)控的致*機(jī)制[5]03FGFR異常形式以及在不同**中的分布FGFR常見變異形式包括基因擴(kuò)增/過表達(dá)、***突變、基因融合等，此外還有重排、激酶結(jié)構(gòu)域重復(fù)及自分泌***等。FGFR的異常表達(dá)已在多種實(shí)體瘤腫中檢測(cè)到，如過表達(dá)常發(fā)生在肺*、腦*、頭頸*、前列腺*等，融合常發(fā)生在骨髓增生綜合征、T細(xì)胞淋巴瘤、膀胱*和肝內(nèi)膽管*等（表1）。

    邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)現(xiàn)有IlluminaNovaSeq6000、NextSeq500、Miniseq測(cè)序儀及QiagenGenereader等一站式臨床診斷測(cè)序平臺(tái)，目前已建立的常規(guī)檢測(cè)能力包括WGS、WES、mRNA-Seq，lncRNA-Seq，miRNA-Seq，靶向富集測(cè)序，單細(xì)胞基因組/轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，免疫組庫(kù)測(cè)序、慢病毒插入位點(diǎn)檢測(cè)等。平臺(tái)多次滿分通過國(guó)家衛(wèi)生部臨檢中心（NCCL）及美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（CAP）組織的室間質(zhì)評(píng)與能力認(rèn)證；已完成20+方法學(xué)開發(fā)與驗(yàn)證，支持40多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)，完成了數(shù)千例余例樣本的檢測(cè)。6、全外顯子組測(cè)序一種生物的外顯子序列的測(cè)序，外顯子測(cè)序需要將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進(jìn)行測(cè)序；人的外顯子序列只占全部基因序列的1%，約30MB，是基因組的編碼序列；相對(duì)于基因組測(cè)序分析的信息量小，成本較低。7、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的測(cè)序，廣義上包括mRNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA及非編碼RNA；狹義指所有mRNA的**。8、靶向測(cè)序作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)目前已完成約30+靶點(diǎn)的方法學(xué)驗(yàn)證，50+靶點(diǎn)的方法學(xué)建立。

    套峰細(xì)分的話有如下幾種情形:全雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒中含有多個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)；如樣品為PCR產(chǎn)物，則含有非特異性擴(kuò)增。前端雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則其含有多個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，并且其中一套模板出現(xiàn)測(cè)序中斷的現(xiàn)象；如樣品為PCR產(chǎn)物，則PCR產(chǎn)物中含有多個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，或者PCR產(chǎn)物中含有引物二聚體等小片段污染。中間雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒并非單克??；如樣品為PCR產(chǎn)物，則部分產(chǎn)物中具有堿基缺失現(xiàn)象，或目的基因?yàn)榈任换驅(qū)е翽CR產(chǎn)物自身不純。后端雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒并非單克??；如樣品為PCR產(chǎn)物，則部分產(chǎn)物中具有堿基缺失現(xiàn)象。解決辦法：針對(duì)二聚體及小片段干擾的情況，可以使用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物；針對(duì)含有多個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)的情況，應(yīng)當(dāng)更換測(cè)序引物；針對(duì)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)堿基缺失的情況，可以使用克隆后測(cè)序以排除堿基缺失的產(chǎn)物；針對(duì)非單克隆的情況，應(yīng)在確認(rèn)克隆無(wú)誤的前提下重新挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序；針對(duì)PCR產(chǎn)物含有非特異性擴(kuò)增的情況，應(yīng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件去除非特異性擴(kuò)增，重新制備樣品測(cè)序；針對(duì)等位基因具有雙模板的情況，應(yīng)當(dāng)采用克隆測(cè)序以保證單次測(cè)序樣品序列一致。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)圍繞生物標(biāo)志物研究、伴隨診斷開發(fā)，建立了完善的核酸組學(xué)、蛋白組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)技術(shù)平臺(tái)。江蘇多組學(xué)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具體包括全套的Leica組織樣本制備系統(tǒng)，Ventana、Leica、DAKO等全自動(dòng)免疫組化儀。江蘇多組學(xué)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富

    既節(jié)約時(shí)間又降低測(cè)序成本。目前，基于法庭科學(xué)領(lǐng)域運(yùn)用**多的ngs系統(tǒng)為illumina公司的miseqfgxtm系統(tǒng)和thermofisher公司的iontorrentpgmtm系統(tǒng)，但針對(duì)以上平臺(tái)的二代測(cè)序商業(yè)化str分型試劑盒的研發(fā)尚處于起步階段，主要有powerseqautosystem(promega，madison，wi,usa)、forenseqtmdnasignatureprepkit(illumina，sandiego，ca，usa)和precisionidglobalfilerngsstrkit(termofisher，waltham，ma，usa)。但以上試劑盒涉及的y-str相對(duì)較少，三個(gè)試劑盒分別包含了1個(gè)y-str基因座、26個(gè)y-str基因座、2個(gè)y-str基因座。同時(shí)存在試劑盒價(jià)格昂貴，配套的數(shù)據(jù)分析軟件只能針對(duì)各自開發(fā)試劑盒，參數(shù)的設(shè)置相對(duì)固定，只能對(duì)固有基因座的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不利于法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用。因此，構(gòu)建一種適用于當(dāng)前主流二代測(cè)序檢測(cè)平臺(tái)miseqfgxtm系統(tǒng)及開放性測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件straitrazor、myflq等，且能容納更多y-str基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系具有一定的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是制備檢測(cè)更多y-str基因座的試劑盒，提高了父系親緣關(guān)系分析能力和鑒定效能。本發(fā)明首先保護(hù)引物組合，可包括引物1—引物120；引物1—引物120均為單鏈dna分子，核苷酸序列依次可如seqid**—seqid**20所示。江蘇多組學(xué)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)豐富