四川一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)68個(gè)基因座的試劑盒及其使用的引物組合，尤其涉及基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)67個(gè)y-str基因座和amelogenin基因座的試劑盒及其使用的引物組合。背景技術(shù)：短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat，str)是由2～6bp重復(fù)單位串聯(lián)組成且***存在于人類基因組中的一類具有長(zhǎng)度多態(tài)性的dna序列，是目前法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定應(yīng)用*****的遺傳標(biāo)記。人類y染色體短串聯(lián)重復(fù)(y-chromosomeshorttandemrepeats，y-str)具有父系遺傳、缺乏重組、分型簡(jiǎn)單、信息量大、多態(tài)性高等特點(diǎn)，是研究人類的起源進(jìn)化、民族差異、種族差異、群體及地區(qū)分布等的有力工具。因此，y染色體str基因座多態(tài)性研究可為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定提供重要手段，在諸如父系家族的親權(quán)鑒定、混合斑男性成分的檢測(cè)、不同男性個(gè)體混合物的分析、追溯父系遷移歷史及重構(gòu)同一父系家族等方向都具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。目前，熒光標(biāo)記多重?cái)U(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳(fluorescentlabeledmultiplexpcr-capillaryelectrophoresis，pcr-ce)是str分型的主流技術(shù)；常用的商業(yè)化y-str分型試劑盒有y23(promega)、y(promega)、yfiler(thermofisherscientific)和yfilerplus。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)利用數(shù)字PCR進(jìn)行低豐度突變研究等；提供循環(huán)腫l瘤DNA檢測(cè)，可檢測(cè)EGFR、ERBB2等Biomarker。四川一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    目前市場(chǎng)上**成功的商業(yè)化多重PCR建庫技術(shù)是ThermoFisher公司的Ampliseq技術(shù)，該技術(shù)可以在同一孔反應(yīng)中完成上千對(duì)引物的擴(kuò)增，使得多個(gè)靶標(biāo)區(qū)域的富集可以通過一次PCR反應(yīng)完成，隨后加上IonTorrent測(cè)序平臺(tái)的通用接頭建好文庫用于二代測(cè)序。然而，這個(gè)產(chǎn)品存在**大的缺陷是客戶定制化的panel設(shè)計(jì)生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，需要兩到三個(gè)月，嚴(yán)重的增加了時(shí)間成本；并且每個(gè)樣本的建庫費(fèi)用高達(dá)1000-2000元，致使其經(jīng)濟(jì)成本極高；另外該試劑盒只適用于IonTorrent測(cè)序平臺(tái)，受平臺(tái)因素影響大，亦不利于測(cè)序費(fèi)用的降低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于以上問題，本發(fā)明提供了一種基于多重PCR的二代測(cè)序建庫技術(shù)，該技術(shù)可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問題，對(duì)于客戶定制化的panel設(shè)計(jì)生產(chǎn)周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個(gè)樣本建庫的成本，且在IonTorrent和Illumina測(cè)序平臺(tái)都通用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明中用到了兩輪多重PCR來建庫。首先針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)區(qū)域或者靶標(biāo)位點(diǎn)，需要設(shè)計(jì)兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測(cè)序平臺(tái)通用的測(cè)序接頭。上游的引物OP用于***輪多重PCR。四川提供邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)推薦咨詢邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有3D HISTECH Pannoramic MIDI數(shù)字化病理掃描儀及91360遠(yuǎn)程病理系統(tǒng)。

    2005年，羅氏推出了***款二代測(cè)序儀羅氏454，生命科學(xué)開始進(jìn)入高通量測(cè)序時(shí)代。后續(xù)隨著Illumina系列測(cè)序平臺(tái)的推出，極大降低了二代測(cè)序的價(jià)格，推動(dòng)了高通量測(cè)序在生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域的普及。目前，高通量測(cè)序已經(jīng)成為一種常規(guī)研究方法，大量科研工作中均會(huì)用到。然而，為什么二代測(cè)序能實(shí)現(xiàn)高通量？為什么二代測(cè)序讀長(zhǎng)如此之短？為什么reads末端測(cè)序質(zhì)量會(huì)降低？應(yīng)該如何選擇測(cè)序讀長(zhǎng)與打斷片段的長(zhǎng)度？想要回答這些問題，都需要詳細(xì)了解二代測(cè)序的基本原理。本篇文章以典型的Illumina雙末端測(cè)序?yàn)槔?，詳?xì)解析二代測(cè)序的原理。第二代測(cè)序（Next-generationsequencing，NGS）又稱為高通量測(cè)序（High-throughputsequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測(cè)序技術(shù)。我們都知道一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序，而二代測(cè)序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序（SequencingbySynthesis）。二代測(cè)序在DNA復(fù)制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記（一般為熒光分子標(biāo)記）來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche的454FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代測(cè)序中，單個(gè)DNA分子必須擴(kuò)增成由相同DNA組成的基因簇，然后進(jìn)行同步復(fù)制。

    吸棄上清。f.每孔加入100uL80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。短時(shí)離心，吸棄上清。g.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入30uLNFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。h.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉(zhuǎn)移上清到新的孔板中。實(shí)施例3.多重PCR一、***輪多重PCRa.按照QubitdsDNAHSAssayKit操作手冊(cè)檢測(cè)樣品濃度，根據(jù)Qubit檢測(cè)的樣本濃度，每個(gè)樣品取同樣的量(10ng)，每5～10個(gè)樣本混合在一起轉(zhuǎn)移到新的孔板中。b.***輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個(gè)左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到，多個(gè)引物混成一個(gè)OP引物池做為***輪PCR的上游引物。配置PCR總體系,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時(shí)離心。c.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-1st程序運(yùn)行2個(gè)小時(shí)。二、PCR產(chǎn)物純化，取下孔板，打開蓋子，每孔加入60uL的磁珠，吹打混勻，室溫下孵育5分鐘。b.將孔板或八聯(lián)管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。c.每孔加入100uL80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。d.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入20uLNFW，吹打混勻重懸磁珠。邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)獲得了歐盟ISO 13485質(zhì)量認(rèn)證并通過了國(guó)家醫(yī)療器械GMP稽查。

    二、一代測(cè)序簡(jiǎn)介1、發(fā)生和發(fā)展***代測(cè)序技術(shù)是Sanger于20世紀(jì)70年代中末期發(fā)明的雙脫氧鏈終止測(cè)序法，手動(dòng)測(cè)序，用同位素標(biāo)記，Sanger也因此獲得其第2個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)（在Sanger發(fā)明雙脫氧鏈終止測(cè)序法前WalterGilbert發(fā)明化學(xué)降解法測(cè)定DNA序列）；80年代出現(xiàn)***臺(tái)自動(dòng)化測(cè)序設(shè)備，熒光標(biāo)記代替同位素，計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別；90年代中期測(cè)序儀重大改進(jìn)，毛細(xì)管電泳替代凝膠電泳；2003年完成人類基因組測(cè)序工作。2、基本原理以單條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)鏈，在DNA復(fù)制過程中，合成原料（2’脫氧核苷酸dNTP）中摻入標(biāo)記過的2’3’ddNTP（雙脫氧鏈終止測(cè)序法由此而來），就會(huì)產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長(zhǎng)度分辨。不同末端終止DNA鏈的長(zhǎng)度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置的ddNTP決定的。經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以得到一系列長(zhǎng)度不同的產(chǎn)物，由于ddNTP帶有熒光標(biāo)記，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，并用相應(yīng)的儀器進(jìn)行檢測(cè)，就可以讀出模板的序列。鏈終止法反應(yīng)的**仍是PCR法。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)利用新一代智能技術(shù)補(bǔ)充傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的檢測(cè)模式，賦能醫(yī)療健康建設(shè)，更好地為臨床和患者服務(wù)。四川提供邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)推薦咨詢

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    同時(shí)操作更為簡(jiǎn)單，整個(gè)上機(jī)測(cè)序可在（文庫構(gòu)建時(shí)間除外）。其劣勢(shì)在于芯片的通量并不高，非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測(cè)序。小結(jié)：二代測(cè)序相比一代測(cè)序大幅降低了成本，保持了較高準(zhǔn)確性，并且大幅降低了測(cè)序時(shí)間，將一個(gè)人類基因組從3年降為1周以內(nèi)，但在序列讀長(zhǎng)方面比起***代測(cè)序技術(shù)則要短很多，這也給三代測(cè)序提供了發(fā)展空間。三、獨(dú)辟蹊徑補(bǔ)空缺三代測(cè)序：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序背景：測(cè)序技術(shù)經(jīng)過***代、第二代的發(fā)展，讀長(zhǎng)從一代測(cè)序的近1000bp，降到了二代測(cè)序的幾百bp，通量和速度大幅提升，那么第三代測(cè)序的發(fā)展思路在于保持二代測(cè)序的速度和通量?jī)?yōu)勢(shì)同時(shí)，彌補(bǔ)其讀長(zhǎng)較短的劣勢(shì)。三代測(cè)序與前兩代相比，**大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1、Oxfordnanopore納米孔+電流檢測(cè)技術(shù)原理：該技術(shù)設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭，**終得到電信號(hào)而不是光信號(hào)或pH信號(hào)的測(cè)序技術(shù)。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí)，電荷將發(fā)生變化，因而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測(cè)到這些變化從而鑒定所通過的堿基。優(yōu)勢(shì)劣勢(shì)：①讀長(zhǎng)很長(zhǎng)，大約在幾十kb，甚至100kb；②錯(cuò)誤率目前相比較高。四川一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦