焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測(cè)新的金標(biāo)準(zhǔn)。焦磷酸測(cè)序作為一種新的序列分析技術(shù)，能夠快速地檢測(cè)甲基化的頻率，對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，為甲基化研究提供了新的途徑。在序列延伸過程中，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個(gè)位點(diǎn)的C-T比例。因此，不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測(cè)，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。QIAGEN公司在焦磷酸測(cè)序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，目前提供三種焦磷酸測(cè)序儀器，通量由低到高，適合不同的應(yīng)用。PyroMarkQ24的強(qiáng)項(xiàng)在于可對(duì)多達(dá)24個(gè)樣品進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMarkQ96ID上進(jìn)行。在考慮到處理成百上千個(gè)樣品所需的大量試劑時(shí)，運(yùn)行通量**化可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)成本變得很高。而PyroMarkQ96MD裝有一臺(tái)高度靈敏的光檢測(cè)攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對(duì)少量的DNA模板進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序。這些不同平臺(tái)的推出，對(duì)于我們實(shí)際研究提供了更有效的檢測(cè)手段。 中小樣本篩選, 大樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢
WGBS送樣要求一、送樣類型基因組DNA、細(xì)胞、全血、動(dòng)植物組織、FFPE二、保存方式1、基因組DNA、細(xì)胞、全血、動(dòng)植物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間避免反復(fù)凍融。2、FFPE樣本：室溫保存三、運(yùn)輸條件1、基因組DNA：冰袋或者干冰運(yùn)輸；2、細(xì)胞、全血、組織樣本：干冰運(yùn)輸，順豐陸運(yùn)（3-4天時(shí)間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；3、FFPE樣本：室溫運(yùn)輸。四、樣本量要求1、基因組DNA：常規(guī)WGBS，不少于2ug；微量WGBS，20ng1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA，要加RNA酶，去除RNA污染；3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測(cè)濃度，基于OD值的檢測(cè)方法，例如NanoDrop,會(huì)嚴(yán)重高估濃度。2、細(xì)胞樣本：常規(guī)WGBS，不少于5x10*6個(gè)細(xì)胞；微量WGBS，5000個(gè)細(xì)胞1）收集貼壁或者懸浮細(xì)胞、使用預(yù)冷的1×PBS，洗滌2次，600g離心5分鐘；2）***一次離心后，盡量去除上清PBS，保留細(xì)胞沉淀;3、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。4、動(dòng)植物組織：動(dòng)物組織，30mg以上;植物組織，不同組織。 北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢6mA在細(xì)菌、藻類及動(dòng)植物基因組中存在。
微生物定植對(duì)腸道免疫和代謝相關(guān)基因DNA甲基化的影響——團(tuán)隊(duì)成員發(fā)表
Early microbial colonization
affects DNA methylation of genes related to intestinal immunity and metabolism
in preterm pigs. DNA Res. 2018 Jan 19. (IF= 5.415)
我們以早產(chǎn)幼豬為模型，采用RRBS測(cè)序，比較正常(CON,
n=7) 和口服*** (AB, n=7)早產(chǎn)豬的腸道DNA甲基化差異，發(fā)現(xiàn)***減少了細(xì)菌密度及多樣性，同時(shí)改變了DNA甲基化水平。其中與先天免疫應(yīng)答、吞噬、內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)和組織代謝等相關(guān)基因的DNA甲基化和表達(dá)存在***的差異。這種有賴腸道菌群的表觀遺傳修飾參與調(diào)控腸道免疫及營養(yǎng)代謝等，可能對(duì)早產(chǎn)兒的短期和長期的腸道健康至關(guān)重要。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1、ChIP-Seq 能實(shí)現(xiàn)真正的全基因組分析。目前所能獲得的芯片上固定的探針只能**全基因組部分序列，所獲得的雜交信息具有偏向性。
2、對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)分析，ChIP-Seq 通過尋找“峰”，結(jié)合分辨率可精確到10~30 bp，而芯片上探針由于長度所限，無法精確定位，即使目前比較高水平的商業(yè)芯片都無法提供可與ChIP-Seq 媲美的分辨率。
3、是所需樣本數(shù)量。ChIP-chip 需要多達(dá)4~5 μg?的起始樣本，在雜交之前需要進(jìn)行LM-PCR，但可能導(dǎo)致背景增高，競爭性擴(kuò)增等導(dǎo)致假陽性。而ChIP-Seq *需要納克級(jí)起始材料，如SOLiD 起始材料可低至20ng。 WGBS用于人、哺乳動(dòng)物及農(nóng)林牧漁方向的高水平甲基化研究。
熒光定量法（Methylight）
這種技術(shù)是在MSP技術(shù)上發(fā)展起來的，在MSP擴(kuò)增過程中利用熒光染料進(jìn)行定量。TaqMan? 探針法的應(yīng)用使得該技術(shù)具有更高的精確性。其原理與SNP檢測(cè)類似，針對(duì)亞硫酸氫鹽處理之后的DN**段，在甲基化位點(diǎn)上會(huì)存在單堿基的差異，根據(jù)這種差異進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，就能夠檢測(cè)甲基化的差異。這種方法**的優(yōu)勢(shì)在于其高敏感性和較高通量，且無需在PCR后電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。但是TaqMan? 探針訂購費(fèi)用較高，適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本篩選。 云生物提供測(cè)序服務(wù)。北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢
全基因組甲基化測(cè)序是將重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合。北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢
甲基化特異性PCR（MS-PCR）
DNA在亞硫酸氫鹽作用后，DNA CpG若無甲基化，則序列中的C改變?yōu)閁，若有甲基化則保持不變，因此從理論上講，用不同的引物做PCR，即可檢測(cè)出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變，就可以相應(yīng)設(shè)計(jì)M和U引物，有時(shí)我們需要設(shè)計(jì)兩輪引物。
這種方法靈敏度高，無需特殊儀器，因此經(jīng)濟(jì)實(shí)用，是目前應(yīng)用**為***的檢測(cè)方法。不過也存在一定的局限性，預(yù)先需要知道待測(cè)片段的DNA序列，引物的設(shè)計(jì)非常重要。另外，亞硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵，若處理不完全則可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。 北京TBS技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢