WGBS送樣要求一、送樣類型基因組DNA、細胞、全血、動植物組織、FFPE二、保存方式1、基因組DNA、細胞、全血、動植物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間避免反復(fù)凍融。2、FFPE樣本：室溫保存三、運輸條件1、基因組DNA：冰袋或者干冰運輸；2、細胞、全血、組織樣本：干冰運輸，順豐陸運（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；3、FFPE樣本：室溫運輸。四、樣本量要求1、基因組DNA：常規(guī)WGBS，不少于2ug；微量WGBS，20ng1）提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；2）提取基因組DNA，要加RNA酶，去除RNA污染；3）提取基因組DNA，溶到TE或者elutionbuffer,避免溶解到純水；樣本體積不超過100ul;4）提供Qubit檢測濃度，基于OD值的檢測方法，例如NanoDrop,會嚴重高估濃度。2、細胞樣本：常規(guī)WGBS，不少于5x10*6個細胞；微量WGBS，5000個細胞1）收集貼壁或者懸浮細胞、使用預(yù)冷的1×PBS，洗滌2次，600g離心5分鐘；2）***一次離心后，盡量去除上清PBS，保留細胞沉淀;3、全血樣本：2-5ml外周血使用普通EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。4、動植物組織：動物組織，30mg以上;植物組織，不同組織。 在哺乳動物中CpG以兩種形式存在。上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案
Agilent甲基化芯片通過SurePrint芯片合成**技術(shù)，結(jié)合優(yōu)化的探針設(shè)計及實驗方法，可靈活進行甲基化研究，得到高靈敏度、高特異性、高重復(fù)性的結(jié)果。技術(shù)流程：1.將基因組DNA超聲打斷成400-500bpDN**段；2.加熱變性并將變性后的單鏈DNA樣品分成兩份；3.其中一份單鏈DNA樣品加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗體。使用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DN**段的抗體復(fù)合物，樣品中其余的非甲基化DN**段被洗脫；4.純化免疫共沉淀的DN**段；對MeDIP(Cy5)與Input(Cy3)樣品分別進行標記；5.標記后的MeDIP與Input樣品混合、變性，與芯片雜交；6.檢測雜交信號并進行數(shù)據(jù)分析。芯片種類：Agilent**甲基化芯片，8x60K●和合作伙伴在Agilent公司定制的Promoter芯片。●絕大多數(shù)基因是針對基因啟動子區(qū)域的CpG島設(shè)計探針?！裥酒弦还灿?160個功能注釋比較明確的基因，其中2128個和**發(fā)生有關(guān)系?！駨墓δ苌戏郑?56基因和細胞凋亡有關(guān)，1273個基因和信號傳導(dǎo)有關(guān)，487個基因和壓力和衰老有關(guān)?！裉貏e適用于**甲基化研究。 上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案FFPE樣本只需要室溫運輸。
發(fā)育基因的表觀突變是養(yǎng)殖歐洲鱸魚開始馴化的基礎(chǔ)
Epimutations in developmental
genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30 (IF= 14.797)
本研究通過RRBS測序，比較了早期馴化的
(n=12)與野生的(n=12)
歐洲鱸魚在馴化過程中DNA甲基化變化，發(fā)現(xiàn)早期馴化的鱸魚與野生的沒有遺傳差異，但在不同胚胎起源的組織中發(fā)生DNA甲基化變化。這些甲基化突變與經(jīng)過25年選擇性育種后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多態(tài)性***重疊，表觀突變基因與正選擇基因一致。結(jié)果表明馴化初始階的表觀變異是一個重要事件。
全基因組甲基化測序(WholeGenomeBisulfiteSequencing,WGBS)是結(jié)合重亞硫酸鹽Bisulfite處理和高通量測序，對有參考基因組進行全基因組的單堿基分辨率的甲基化檢測“金標準”方案，***用于人、哺乳動物及農(nóng)林牧漁方向的高水平甲基化研究。WGBS滿足全基因組DNA甲基化圖譜及疾病關(guān)聯(lián)分析、基因調(diào)控分析、疾病的甲基化標志物篩選等探索性課題的研究。靈長類早期著床前胚胎發(fā)育中的DNA甲基化重編程研究——(團隊成員發(fā)表).(IF=)靈長類胚胎發(fā)生的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控需要DNA甲基化重編程。我們首先建立了基于轉(zhuǎn)座酶的超微量WGBS測序技術(shù)，詳細研究了獼猴早期著床前胚胎7個階段(Sperm、Oocytes、Zygotes、2-cell、8-cell、Morula和ICM)的DNA甲基化動態(tài)變化過程。******闡明了DNA甲基化動力學(xué)的“盈與虧”階段特征，并通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失實驗表明DNA甲基化影響早期猴胚胎發(fā)育。 中小樣本篩選, 大樣本中進一步驗證。
**預(yù)防和***的一個手段是通過去甲基化恢復(fù)某些關(guān)鍵的抑*基因或DNA修復(fù)基因的活性，目前研究**多的是DNMTs***劑，它通過***DNMT活性以逆轉(zhuǎn)異常的DNA甲基化。**個表型修飾藥物為5-azacytidine及其類似物5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-CdR），這類藥物已經(jīng)美國FDA批準用于白血病前骨髓增生異常綜合征的***。5-aza-CdR是胞嘧啶的類似物，在DNA復(fù)制過程中可以摻入到DNA鏈中，一方面它可以降低DNA接收甲基的能力，另一方面它***DNMT活性，導(dǎo)致DNA甲基化水平的降低。體外和體內(nèi)試驗均表明，5-aza-CdR具有降低超甲基化的抑*基因甲基化水平從而*****的能力，臨床表明應(yīng)用5-aza-CdR可提高部分IV期小細胞肺*患者生存率，但該藥也存在著不可忽視的毒副作用（如特異性不強，不能針對某一特定抑*基因進行靶向***；高劑量的5-aza-CdR可能誘發(fā)**的轉(zhuǎn)移），因此其在臨床上的應(yīng)用受到了很大限制。也有研究表明，低劑量的As2O3可起到***肝*的目的。 RRBS用于人、哺乳動物及魚類方向的高水平甲基化研究。上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案
RRBS開發(fā)的初衷就是為人和哺乳動物，提供全基因組范圍的、高性價比的甲基化檢測金標準方案。上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案
羥甲基化DNA免疫沉淀測序（HydroxymethylatedDNAImmunoprecipitationSequencing，hMeDIP-Seq）是通過5hmC特異性抗體富集羥甲基化的DN**段，然后結(jié)合高通量測序技術(shù)在全基因組水平上以較小的數(shù)據(jù)量，快速、高效地尋找羥甲基化區(qū)域?？蓮V泛應(yīng)用于羥甲基化與疾病關(guān)系研究以及羥甲基化在胚胎發(fā)育過程中的研究。技術(shù)優(yōu)勢從項目背景了解、協(xié)助方案設(shè)計、實驗材料選取、建庫測序，到數(shù)據(jù)分析每個項目有特定的科學(xué)問題；需要專業(yè)、有價值的建議；科學(xué)、縝密的設(shè)計及時高效的溝通；以保障高質(zhì)量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=3ug；樣品濃度>50ng/ul；無RNA和蛋白污染建庫測序：測序策略：IlluminaHiSeq,PE150;測序深度：20-30Mreads信息分析基于全基因組范圍的羥甲基化分析，數(shù)據(jù)質(zhì)控，Peak鋒Calling，Peak鋒在基因組、染色體、功能元件上的分布，多樣本羥甲基化差異聚類，差異羥甲基化DMR鑒定及相關(guān)基因的功能分析，結(jié)合項目背景和科學(xué)問題的數(shù)據(jù)亮點挖掘。 上海ATAC技術(shù)服務(wù)方案