亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)
這種方法一度被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計引物進行PCR擴增目的片段，并對PCR產(chǎn)物進行克隆測序，將序列與未經(jīng)處理的序列進行比較，判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)，但因為涉及到測序，其結(jié)果準(zhǔn)確但要求克隆時所挑克隆較多，操作繁瑣，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依賴于挑選克隆的數(shù)目，因此這種方法只能算得上是一種半定量的技術(shù)方法。
目前一般會先用BSP找到甲基化位點，然后根據(jù)甲基化位點設(shè)計MSP引物，進行相應(yīng)PCR條件摸索，以用于大量樣本的篩選。 FFPE樣本只需要室溫運輸。江蘇技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢
甲基化是表觀修飾的重要部分，DNA甲基化可以引起DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因表達。DNA鏈中含有很多CpG結(jié)構(gòu)，雙鏈DNACpG中的胞嘧啶五位碳原子通常容易被甲基化，基因組中60~90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇出現(xiàn)在基因啟動子**序列或者轉(zhuǎn)錄起始位點。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶可以催化CpG的甲基化反應(yīng)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶有兩種，Dnmt1是一種持續(xù)性甲基化轉(zhuǎn)移酶，作用于只有一條鏈甲基化的DNA雙鏈，使其完全甲基化，參與DNA復(fù)制過程中新合成鏈的甲基化修飾；Dnmt3a/Dnmt3b是一種從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以在CpG上產(chǎn)生新的甲基化修飾，首先半甲基化，繼而全甲基化，該甲基化轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞生長分化的調(diào)控，在**基因甲基化中起到重要作用。近年來CRISPR/Cas9技術(shù)得到快速發(fā)展，在基因切割活性失活的dCas9的5’端融合一個Dnmt3a，能夠通過dCas9介導(dǎo)特定位點的甲基化修飾，調(diào)控相關(guān)基因的表達。 山東RRBS技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗豐富ATAC-seq實驗過程短，從實驗到分析可達2周。
隨著二代測序技術(shù)的告訴發(fā)展，測序成本大幅度下降，使得真正實現(xiàn)全基因組甲基化分析的研究成為可能。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經(jīng)陸續(xù)有多個物種的甲基化圖譜構(gòu)建完成。研究者將傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測方法，如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測序相結(jié)合，可以實現(xiàn)單堿基精度的甲基化圖譜的構(gòu)建。此外將成熟的MeDIP技術(shù)與二代測序相結(jié)合，可以快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。因此該技術(shù)也特別適用于大樣本量的疾病表觀研究。第三代測序技術(shù)的出現(xiàn)，更是讓甲基化的直接測定成為可能。一年前，美國PacificBiosciences公司利用獨有的單分子實時(SMRT)測序技術(shù)，直接測定了DNA的甲基化。這項成果發(fā)表在《NatureMethods》雜志上。
DNA甲基化異常用于甲狀腺結(jié)節(jié)診斷
Identification of
Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin
Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551 (IF=
10.199)
惡性結(jié)節(jié)和良性結(jié)節(jié)常常難以診斷。本課題通過RRBS檢測了109個甲狀腺組織的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)*旁、良性結(jié)節(jié)和*組織之間存在***差異，并在65個甲狀腺結(jié)節(jié)的回顧性隊列樣本中得到驗證。這些組織特異性DMR與活性增強子和**相關(guān)基因密切相關(guān)，表明DNA甲基化為甲狀腺結(jié)節(jié)提供準(zhǔn)確的診斷。 云生物提供DNA甲基化和羥甲基化的表觀實驗和信息分析技術(shù)服務(wù)。
DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)研究的重要范疇，已經(jīng)越來越受到研究者的關(guān)注。近些年來，隨著DNA甲基化與組蛋白甲基化的聯(lián)合作用機制、RNA干擾機制及去甲基化機制的發(fā)現(xiàn)，使得DNA甲基化研究受到***關(guān)注，從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擴展到動植物研究當(dāng)中，同時在研究方法上也取得了很大的突破?，F(xiàn)在用于DNA甲基化檢測的方法大概有十多種，從應(yīng)用上來分，大致可以分成兩類：全基因組甲基化分析及特異位點甲基化檢測。下面，我們就這兩大類檢測技術(shù)進行分析比較，以便于在實際的科研工作中進行選擇。云生物提供測序服務(wù)。hMeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)服務(wù)
中小樣本篩選, 大樣本中進一步驗證。江蘇技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢
Hepatic
stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA
methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73. (IF= 14.911)
肝星狀細(xì)胞(HSC)是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生和進展的關(guān)鍵細(xì)胞類型。DNA羥甲基化與轉(zhuǎn)錄***有關(guān)，其模式在人類疾病中經(jīng)常發(fā)生改變。研究者采用簡化基因組氧化-亞硫酸鹽測序(RRBS/oxRRBS)檢測靜止和******狀態(tài)的大鼠HSC細(xì)胞的5mC和5hmC水平，證實了5mC和5hmC在肝纖維化和HSC轉(zhuǎn)分化過程中的整體變化，表明DNA甲基化/羥甲基化是HSC***的關(guān)鍵步驟，可能會為支持纖維生成的分子事件帶來新的見解，并可能為疾病進展提供生物標(biāo)志物以及潛在的新藥物靶點。 江蘇技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢