實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物變化。通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。具有專一性更高、可實時監(jiān)控、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢。qPCR的種類根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。蘇州準確qPCR儀設(shè)置
qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團和淬滅基團，它可以特異結(jié)合目的產(chǎn)物的DNA序列。其檢測原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），即熒光基團和淬滅基團在目標DNA分子擴增過程中因為聚合酶的外切活性從而水解分離使熒光信號的釋放；隨著擴增過程的推進，機器實時檢測增強的熒光信號，從而產(chǎn)生終的熒光擴增曲線。根據(jù)修飾基團標記和能量轉(zhuǎn)移方式，可以將探針分為TaqMan探針、分子信標和其他探針。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現(xiàn)今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團的短單鏈寡聚核苷酸。在qPCR反應(yīng)中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，對TaqMan探針進行切割，使熒光基團和猝滅基團分離，熒光基團發(fā)出的熒光信號不會被淬滅，釋放的熒光信號被機器接收。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結(jié)合DNA序列，因而具有更好的特異性，但探針合成價格偏高。華南地區(qū)靈敏度qPCR儀設(shè)置qPCR通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性比較好的定量方法，已得到全世界的公認，范圍廣用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用：由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標對定量PCR的影響：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為***。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現(xiàn)擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。
TwoSteprt-pcr和OneSteprt-pcr的選擇RealTimeRT-PCR反應(yīng)可選擇TwoSteprt-pcr反應(yīng)或OneStepRT-PCR反應(yīng),TwoStepRT-PCR反應(yīng)是將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RealTimePCR反應(yīng)分兩步進行。進行TwoStepRT-PCR反應(yīng)時,可選擇RandomPrimer、OligodtPrimer或基因的特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),然后再將一部分反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(cDNA)作為模板添加到RealTimePCR反應(yīng)液中。使用反轉(zhuǎn)錄引物時可以根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的反轉(zhuǎn)錄引物,如果選擇RandomPrimer或OligodtPrimer,合成的cDNA可用于復(fù)數(shù)種類基因的檢測,cDNA溶液可以穩(wěn)定地長期保存,供以后解析使用。OneSteprt-pcr的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進行,操作簡單,污染幾率低。但此時的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)都并非為各自的適條件,所以O(shè)neSteprt-pcr通常比TwoStepRT-PCR反應(yīng)效率低。此外,與TwoStepPCR反應(yīng)相比,反轉(zhuǎn)錄酶等的使用量多,每個反應(yīng)的成本相對較高。OneSteprt-pcr反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物只能使基因的特異性PCR下游引|物,而不能使用Randomprimer或OligodtPrimer共用引物?；虮磉_解析等絕大部分RT-PCR,適合選擇TwoSteprt-pcr反應(yīng),而RNA病毒檢測等以基因檢測為目的RT-CR反應(yīng),應(yīng)優(yōu)先考慮防止污染,所以比較好選擇OneSteprt-pcr反應(yīng)。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）指的是在PCR進行的同時，對其過程進行監(jiān)測的能力。華南地區(qū)靈敏度qPCR儀設(shè)置
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度。蘇州準確qPCR儀設(shè)置
qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴增過程，然后通過標準曲線來對未知模板進行定量分析。qPCR 主要是依賴于標準品制備標準曲線，進而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環(huán)進行，染料熒光強度增加，從而檢測到定量反應(yīng)的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。蘇州準確qPCR儀設(shè)置
廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司是以數(shù)字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀研發(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)為一體的儀器儀表批發(fā);商品批發(fā)貿(mào)易（許可審批類商品除外）;商品零售貿(mào)易（許可審批類商品除外）;教學(xué)設(shè)備的研究開發(fā);辦公設(shè)備耗材批發(fā);生物技術(shù)開發(fā)服務(wù);生物技術(shù)推廣服務(wù);計算機批發(fā);生物技術(shù)轉(zhuǎn)讓服務(wù);農(nóng)業(yè)科學(xué)研究和試驗發(fā)展;醫(yī)學(xué)研究和試驗發(fā)展;自然科學(xué)研究和試驗發(fā)展;水處理設(shè)備的研究、開發(fā);食品科學(xué)技術(shù)研究服務(wù);環(huán)保設(shè)備批發(fā);辦公設(shè)備批發(fā);企業(yè)，公司成立于2015-04-17，地址在廣州市黃埔區(qū)銳豐三街4號617房。至創(chuàng)始至今，公司已經(jīng)頗有規(guī)模。公司主要產(chǎn)品有數(shù)字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀等，公司工程技術(shù)人員、行政管理人員、產(chǎn)品制造及售后服務(wù)人員均有多年行業(yè)經(jīng)驗。并與上下游企業(yè)保持密切的合作關(guān)系。臻準,美國艾科浦,銳訊生物,Sysmex,Eprerdia致力于開拓國內(nèi)市場，與精細化學(xué)品行業(yè)內(nèi)企業(yè)建立長期穩(wěn)定的伙伴關(guān)系，公司以產(chǎn)品質(zhì)量及良好的售后服務(wù)，獲得客戶及業(yè)內(nèi)的一致好評。廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司通過多年的深耕細作，企業(yè)已通過精細化學(xué)品質(zhì)量體系認證，確保公司各類產(chǎn)品以高技術(shù)、高性能、高精密度服務(wù)于廣大客戶。歡迎各界朋友蒞臨參觀、 指導(dǎo)和業(yè)務(wù)洽談。