qPCR的熒光標記方法分為以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針法為主的熒光探針法（Cycling Probe，Molecular Bracon等），淬滅染料引物法。SYBR Green I 是高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長。它以非特異性方式結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。游離的SYBR Green I 只發(fā)出極弱的熒光信號，PCR過程中，當擴增生成dsDNA時，SYBR Green I 逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被千倍放大，熒光信號的強度與擴增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線”，通過熒光信號的強度反映出體系中dsDNA的濃度。為了增加qPCR實驗可靠性、重復性，需要制定統(tǒng)一的實驗標準來進行規(guī)范。上?？焖賟PCR儀消毒
原理：在DNA擴增反應中，通過熒光化學物質(zhì)測定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量。目的：實現(xiàn)定量而不止是定性分析。通過與內(nèi)參基因進行對比，對樣品中的特定基因進行相對表達量的計算，以實現(xiàn)定量分析。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。上海快速qPCR儀消毒qPCR只能實現(xiàn)相對定量，即必須使用標準品生成標準曲線，才能進行定量。
PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當?shù)木彌_體系。PCR 產(chǎn)物的增長形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環(huán)數(shù))。實際中，擴增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當然是在PCR 的基礎上發(fā)展出來的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR 產(chǎn)物（擴增子，amplicon）的量，擴增曲線（擴增子累積曲線），摻錯率，擴增子長度。一般來說，人們關(guān)心的是擴增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù)；擴增子長度，擴增效率，擴增子多少，也加以考慮。
Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點：精確定量 以可靠的數(shù)據(jù)助力您的研究。采用擬合算法計算 Ct 值，定量誤差不超過±10%。液體冷卻循環(huán)系統(tǒng)確?？组g溫度高度一致，溫差不超過 ±0.15°C。光學系統(tǒng)無運動部件，穩(wěn)定性增加，長期使用無需校準與維護。的儀器間重復性，不同位置、不同反應體積均不影響定量結(jié)果。快速高效 用更短的時間獲得更多數(shù)據(jù)。40 個循環(huán)的常規(guī) qPCR 只需43 分鐘，較常見qPCR 儀多縮短60% 的時間。在提高速度的同時保持了96 孔的高通量，滿足絕大多數(shù)實驗需求。小巧輕便 節(jié)省空間及您的寶貴樣品小體積為移動實驗和大量部署提供可能。5-10 μl 的推薦反應體積，較常規(guī)實驗節(jié)省80%的試劑用量，更節(jié)約您的珍貴樣品。自聚合酶鏈式反應技術(shù)被發(fā)明以來，其簡單、可靠、快速、靈敏的質(zhì)量，PCR是分子生物學中使用的技術(shù)。
制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化現(xiàn)在含有目標蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。定量DNA——測定目標蛋白質(zhì)-DNA水平在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在于特定位點。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)需要針對可變性來源進行標準化，包括染色質(zhì)數(shù)量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。兩種常用的標準化 ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)方法——Percent Input法和富集倍數(shù)法（Fold Enrichmen）。與input相關(guān)的ChIP-qPCR數(shù)據(jù)包括ChIP的背景水平和input染色質(zhì)的標準化。建議ChIP 實驗重復，盡可能將結(jié)果與背景信號和標準誤差一起顯示。由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現(xiàn)擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。佛山快速qPCR儀型號
定量檢測是一種實時的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴增循環(huán)中，檢測目標核酸片段的量。上?？焖賟PCR儀消毒
相對定量實驗方法包括兩種重要方法：ΔΔCT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內(nèi)參基因與目的基因可以同時反應，也可以單獨反應；雙標準曲線法：對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。定量需要由標準曲線建立Ct值跟拷貝數(shù)之間的關(guān)系，標準曲線由標準品生成，標準品可以是已知濃度的RNA、質(zhì)?；蚝铣傻墓押塑账徭溕桑课粗０鍟r標準樣品和未知樣品必須同時反應。上?？焖賟PCR儀消毒
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