蘇州RIP免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨

來源: 發(fā)布時間:2024-06-09

免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)(抗原)之間的特異性相互作用。通過使用針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體,可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型,包括:
1. 個別免疫沉淀法(Individual IP)
2. 免疫共沉淀法(Co-IP)
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)
4. RNA免疫沉淀法(RIP)
近年來,免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進(jìn)步。磁性微珠因其操作簡便、快速和自動化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹脂。
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Co-IP的實(shí)驗步驟:
1. 細(xì)胞裂解:首先,細(xì)胞或組織被裂解,釋放其中的蛋白質(zhì)。
2. 抗體結(jié)合:然后,將特異性抗體(針對已知蛋白質(zhì)之一的抗體)加入到裂解物中。這些抗體會特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白(誘餌蛋白)上。
3. 免疫復(fù)合物形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 沉淀:接著,使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)來捕獲免疫復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合,從而拉下抗體以及與之結(jié)合的目標(biāo)蛋白和任何相關(guān)的相互作用蛋白。
5. 洗滌:捕獲的免疫復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6. 洗脫和分析:免疫復(fù)合物被洗脫并進(jìn)行進(jìn)一步的分析,如Western blot(WB)或質(zhì)譜分析,以鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。
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免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗方法通常包括以下步驟:
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 細(xì)胞裂解:使用裂解緩沖液(含有蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解)裂解細(xì)胞,釋放蛋白質(zhì)。
3. 蛋白質(zhì)濃度測定:使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
4. 抗體預(yù)處理:如果使用預(yù)固定的抗體,需先將抗體固定在固相支持物上,如瓊脂糖珠或磁性微珠。
5. 免疫沉淀反應(yīng):將裂解液與特異性抗體(固定或未固定)混合,并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜,以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
6. 固相支持物的回收:對于未固定的抗體,加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
7. 洗滌:去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì),通常需要多次洗滌固相支持物。
8. 洗脫:使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液(如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液)從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
9. 后續(xù)分析:對洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等,以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。
10. 對照實(shí)驗:包括正對照(已知能沉淀目標(biāo)蛋白的抗體)和負(fù)對照(非特異性抗體或無抗體)以驗證實(shí)驗的特異性。

免疫沉淀(IP)實(shí)驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因為抗體的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型:單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗證:選擇已經(jīng)過免疫沉淀(IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗證的抗體,這增加了實(shí)驗成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價,以幫助做出決策。
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Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,其應(yīng)用場景如下:
1. 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的鑒定:Co-IP可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的結(jié)合伙伴。
2. 信號傳導(dǎo)途徑的研究:通過Co-IP技術(shù),科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多關(guān)鍵的細(xì)胞信號通路,如MAPK和PI3K/Akt通路等,為深入理解這些通路的功能和調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。
3. 藥物靶點(diǎn)篩選:利用Co-IP技術(shù),研究人員可以篩選潛在的藥物靶點(diǎn)。
疾病機(jī)制研究:通過分析疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用,Co-IP有助于揭示疾病的分子機(jī)制。
4. 抗體藥物開發(fā):Co-IP可用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)蛋白的結(jié)合特性,評估抗體藥物的親和力和特異性。
5. 轉(zhuǎn)錄因子研究:Co-IP技術(shù)可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子與蛋白質(zhì)的相互作用,進(jìn)而揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
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免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用。蘇州RIP免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨

免疫沉淀實(shí)驗步驟:
1. 樣品制備
a. 懸浮細(xì)胞樣品處理:離心收集細(xì)胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)。混勻后置于冰上處理10 min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
b. 貼壁細(xì)胞樣品處理:移去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞兩遍;用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞,收集至1.5mL EP管內(nèi),按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)。吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸?;靹蚝笾糜诒咸幚?0 min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
4. 后續(xù):磁珠預(yù)處理——抗體吸附——抗原結(jié)合反應(yīng)——抗體洗脫
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標(biāo)簽: 免疫沉淀 支原體