免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因,
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結(jié)合水平低
IP 應(yīng)用中出現(xiàn)低抗原結(jié)合水平的可能原因有很多,結(jié)合反應(yīng)所使用的溶液是重要原因之一。必須使用適合的緩沖液,有特定的pH和鹽濃度,可能還需要添加互作所需的輔助因子。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個重要因素。如果抗體本身易失活或與抗原結(jié)合微弱,則可能很難找到足夠溫和的條件,即能產(chǎn)生結(jié)合,又能保證在孵育和洗滌過程中結(jié)合可以穩(wěn)定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下,抗原與抗體或結(jié)合蛋白結(jié)合之間可能會發(fā)生極強的相互作用,傳統(tǒng)的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原,則上述矛盾尤為突出。
免疫沉淀技術(shù)IP的實驗設(shè)計。溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理
免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)是一種用于研究細胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。RIP技術(shù)可以幫助我們了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)過程,并發(fā)現(xiàn)miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)靶點。
RIP技術(shù)的原理是利用針對特定RNA結(jié)合蛋白的抗體,將細胞內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來。然后,可以通過分離純化,對這些復(fù)合物中的RNA進行檢測,如qPCR驗證或測序分析。
表觀遺傳學(xué)和RNA生物學(xué)領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注增加。RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對RNA潛能的這一新認識帶動了新方法的發(fā)展,使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。
深圳Protein AG免疫沉淀磁珠的選擇免疫沉淀技術(shù)ChIP的應(yīng)用有哪些?
“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白,進行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實驗。更確切地說,IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體,從復(fù)雜的混合物中,純化單一抗原的實驗。固定化蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝既可以分步進行,也可以一步完成。
常見的加樣順序:抗體和樣本(如細胞裂解物)一起孵育,然后加入親和微珠,用于捕獲抗體-抗原復(fù)合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結(jié)合蛋白,如蛋白A、G或A/G等,直接或間接結(jié)合抗體)先進行孵育,然后再加入含有抗原的樣本。當(dāng)抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后,充分洗滌微珠,再采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。
免疫沉淀純化所得抗原純度低一般有多種原因:
1. 非特異性蛋白污染
如果洗脫所得抗原純度較低,則有幾種方法可以進行優(yōu)化。在結(jié)合或洗滌緩沖液中加入去污劑或其他可以降低非特異性結(jié)合的組分。使用普通微珠預(yù)純化樣本還可以降低非目標(biāo)分子的共純化。此外,還可以使用無關(guān)蛋白 (如BSA) 封閉微珠 。
2. 抗體污染
使用蛋白A、G或A/G的經(jīng)典免疫沉淀實驗中會出現(xiàn)抗體與抗原共洗脫的情況。如果共洗脫會影響下游分析,則需要使用抗體通過共價連接固定至微珠的方法進行實驗,如Pierce 直接 IP 或交聯(lián) IP 的形式。
免疫沉淀樣本的制備。
Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,其實驗設(shè)計如下:
1. 樣品準(zhǔn)備:Co-IP實驗通常有兩種,一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗證,一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗證。內(nèi)源性相互作用通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細胞內(nèi)表達;非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進行預(yù)處理及細胞裂解獲得細胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白:利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體,抗體會與誘餌蛋白結(jié)合,利用磁鐵將磁珠拉下,同時誘餌蛋白會一起被沉淀出來。
3. SDS-PAGE及WB檢測:得到沉淀后,需要驗證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離,隨后利用WB檢測是否存在靶蛋白。
4. 實驗對照設(shè)置:為了避免“假陽性”,需要設(shè)置正確的對照,包括陰性對照和陽性對照(Input組)。Input組為直接利用抗體對細胞裂解液進行WB檢測,驗證細胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實性:確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。
免疫沉淀ChIP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?深圳Protein AG免疫沉淀磁珠的選擇
免疫沉淀RIP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理
RIP技術(shù)的優(yōu)勢在于:
1. 特異性:利用特異性抗體,可以精確地捕獲目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白及其相互作用的RNA。
2. 應(yīng)用場景多:適用于研究RNA結(jié)合蛋白、miRNA、lncRNA等非編碼RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。
3. 技術(shù)結(jié)合:RIP后的RNA可以用于多種下游分析,如qPCR、測序等,為研究RNA的功能和調(diào)控提供了重要信息。
RIP技術(shù)的限制包括:
1. 抗體質(zhì)量:需要高質(zhì)量的特異性抗體,否則可能得到假陽性或假陰性結(jié)果。
2. 非特異性結(jié)合:可能存在非特異性結(jié)合問題,需要仔細的實驗設(shè)計和對照來控制。
溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理
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