杭州細胞培養(yǎng)支原體檢測方法LAMP法

來源： 發(fā)布時間：2024-06-08

檢測新鮮培養(yǎng)基是否有支原體污染，可以采用以下五種方案：
1. 培養(yǎng)法：這是一種傳統(tǒng)且可靠的方法，通過將培養(yǎng)基接種到適宜支原體生長的微生物培養(yǎng)基或瓊脂平板上，觀察是否有支原體生長。這種方法較為耗時，但成本較低。
2. 熒光染色法：使用特定的熒光染料（如Hoechst 33258）對細胞進行染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。如果存在支原體污染，可以看到細胞表面或細胞間隙中支原體DNA的熒光染色。
3. PCR法：通過設(shè)計針對支原體特定序列的引物，利用PCR技術(shù)特異性擴增目標DNA。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如果出現(xiàn)條帶則表明存在支原體污染。
4. 電鏡觀察法：使用電子顯微鏡直接觀察培養(yǎng)細胞中的支原體污染情況。這種方法可以提供直觀的支原體形態(tài)信息，但設(shè)備要求較高。
5. 一步法恒溫支原體檢測：使用特定的試劑盒，如Yeasen一步法恒溫支原體檢測試劑，采用等溫擴增技術(shù)，通過顏色變化（由藍紫色變?yōu)樘焖{色）進行快速檢測。
細胞培養(yǎng)支原體污染怎么檢測？杭州細胞培養(yǎng)支原體檢測方法LAMP法

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支原體污染的來源主要包括以下幾個方面：
1. 實驗室環(huán)境中可能存在支原體污染源，如空氣中的塵埃、其他培養(yǎng)物中的支原體污染等。
2. 實驗操作人員的手部、衣物或皮膚表面可能攜帶支原體，造成細胞培養(yǎng)的污染。
3. 培養(yǎng)基、血清等培養(yǎng)材料如果受到支原體污染，也會導(dǎo)致細胞培養(yǎng)物受到污染。
4. 細胞交叉污染，即使用已受污染的細胞株進行培養(yǎng)時，可能會污染其他細胞。
5. 實驗器材帶來的污染，如未徹底消毒滅菌的實驗器材。
6. 人體是某些支原體的正常菌群，因此操作人員的疏失也可能成為污染源。
7. 細胞庫管理不善，造成實驗室間的相互污染。
8. 細胞培養(yǎng)過程中的細菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可見，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進行檢測
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巢式PCR法和一步法恒溫支原體檢測試劑盒各有優(yōu)缺點，具體哪個更好要根據(jù)實驗需求和條件來決定。
1. 巢式PCR法通過兩輪PCR擴增來提高檢測的特異性和靈敏度。它的優(yōu)點是：
2. 特異性強，可以減少假陽性結(jié)果。
3. 靈敏度高，可以檢測到很低數(shù)量的支原體。
4. 通過設(shè)計多對引物，可以覆蓋多種支原體種類。
不過巢式PCR法也存在一些缺點：
1. 操作復(fù)雜，需要兩輪PCR反應(yīng)。
2. 容易受到PCR抑制物的影響，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 反應(yīng)后需要開蓋電泳檢測，增加了污染的風(fēng)險。
而一步法恒溫支原體檢測試劑盒采用等溫擴增技術(shù)，具有以下優(yōu)點：
1. 操作簡便，只需一次反應(yīng)即可完成檢測。
2. 靈敏度和特異性也很高，可檢出10個拷貝以上的支原體污染。
3. 反應(yīng)后無需開蓋，減少了污染的風(fēng)險。
但一步法試劑盒的缺點是：
1. 靈敏度雖高，但可能略低于巢式PCR法。
2. 價格可能比巢式PCR試劑盒要高。

對于同一個樣品，如果PCR檢測結(jié)果為陽性而一步法恒溫檢測試劑盒結(jié)果為陰性，可能的原因包括：

1. 靈敏度差異：PCR方法通常具有較高的靈敏度，可以檢測到單個拷貝的支原體DNA。相比之下，一步法恒溫檢測試劑盒可能需要更高的支原體拷貝數(shù)才能檢測出陽性結(jié)果，例如需要10^3個拷貝。如果樣品中的支原體數(shù)量低于一步法試劑盒的檢測閾值，就可能出現(xiàn)PCR陽性而一步法陰性的情況。
2. 檢測范圍：PCR檢測可以針對特定的支原體序列設(shè)計引物，如果樣品中的支原體種類或序列與一步法試劑盒的檢測范圍不完全匹配，可能導(dǎo)致一步法檢測不出。
3. 樣品處理和提?。阂徊椒ê銣貦z測試劑盒可能對樣品的處理和DNA提取有特定的要求。如果樣品處理不當或DNA提取效率不高，可能會影響一步法試劑盒的檢測結(jié)果。
4. 試劑盒特異性：一步法恒溫檢測試劑盒可能設(shè)計用于檢測特定的支原體種類，如果樣品中的支原體與試劑盒的特異性不匹配，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
5. 抑制物的影響：PCR檢測可能對樣品中的某些抑制物不那么敏感，而一步法恒溫檢測試劑盒可能更容易受到這些抑制物的影響，從而降低檢測的靈敏度。
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細胞培養(yǎng)中如果污染了支原體，會有以下幾種影響：

1. 細胞生長受影響：支原體污染會導(dǎo)致細胞生長速度減慢，甚至停止生長。細胞可能會變圓，從培養(yǎng)瓶壁脫落。
2. 細胞形態(tài)變化：雖然某些細胞在支原體污染后形態(tài)變化不明顯，但有些細胞會出現(xiàn)體積增大，細胞碎片增多，培養(yǎng)瓶中細胞間隙出現(xiàn)膜狀沉積等現(xiàn)象。
3. 代謝和功能改變：支原體污染會影響細胞的代謝和功能，例如培養(yǎng)液中的精氨酸被大量消耗，引起細胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙。支原體活動還可能引起培養(yǎng)液成分和pH值的變化。
4. 實驗結(jié)果受影響：使用被支原體污染的細胞進行實驗會嚴重影響實驗結(jié)果，因為支原體會抑制細胞生長，導(dǎo)致染色體畸變，細胞膜抗原性改變，細胞復(fù)蘇后存活率降低等。
5. 細胞培養(yǎng)環(huán)境的污染：一株污染的細胞可能成為實驗室的污染源，對工作區(qū)域以及培養(yǎng)箱和液氮罐造成污染，進而污染其他細胞，導(dǎo)致其他細胞繼發(fā)性污染。
6. 科研結(jié)果的重復(fù)性問題：由于支原體污染，某些實驗結(jié)果可能能在支原體陽性的細胞中得到，導(dǎo)致科研結(jié)果的重復(fù)性受到影響
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細胞庫支原體檢測的必要性主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
1. 確保細胞庫的質(zhì)量與安全性：細胞庫的建立需要為生物制品的生產(chǎn)提供檢定合格、質(zhì)量相同、能持續(xù)穩(wěn)定傳代的細胞。支原體檢測是確保細胞庫中細胞質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。
2. 符合監(jiān)管要求：支原體檢測是生物制品安全性監(jiān)管的一部分，全球范圍內(nèi)的藥典、法規(guī)和指導(dǎo)文件中都有支原體檢測的相關(guān)說明。
3. 避免對生物制品的影響：支原體污染可能會影響生物制品的安全性和有效性，因此需要通過檢測來避免這種風(fēng)險。
4. 維護細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性：支原體是真核細胞和干細胞培養(yǎng)中最常見的問題之一，它們可以改變細胞的代謝、減緩增殖速度，甚至引起染色體畸變。
5. 預(yù)防交叉污染：由于支原體可以通過氣溶膠和微粒污染實驗室其他區(qū)域，支原體檢測有助于預(yù)防交叉污染的發(fā)生。
6. 保障數(shù)據(jù)的可靠性：支原體污染可能會影響實驗結(jié)果的準確性，因此定期進行支原體檢測有助于保障研究數(shù)據(jù)的可靠性。
7. 常規(guī)監(jiān)測的重要性：支原體應(yīng)成為細胞培養(yǎng)實驗室的常規(guī)監(jiān)測項目，以確保細胞培養(yǎng)的質(zhì)量和安全。
8. 遵守藥典規(guī)定：根據(jù)中國藥典的規(guī)定，每8~12代細胞培養(yǎng)物應(yīng)進行支原體檢查，以符合規(guī)定。
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