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    thermofisherscientific)等。研究發(fā)現(xiàn)，基于pcr-ce分型時，相同片段長度的等位基因中存在重復區(qū)域序列結構不一致的情況。二代測序技術(secondgenerationsequencing，sgs)又稱為下一代測序技術(nextgenerationsequencing，ngs)，具有測序通量高、速度快的優(yōu)點。ngs不僅能從長度多態(tài)性上對str基因座進行分析，還能從序列上發(fā)掘str基因座的遺傳多態(tài)性。隨著ngs測序成本越來越低、測序讀長逐漸的增加，ngs對str分型技術也越來越成熟。近年來，ngs技術已經(jīng)應用于法醫(yī)學str分型研究。相比于pcr-ce分型，ngs技術在y-str基因座的分析中具有很多優(yōu)勢：1、樣本輸入量低，使得微量樣本及降解樣本檢材的分型研究變?yōu)榭赡埽?、準確性高，能夠全部覆蓋基因座的每個堿基并通過產(chǎn)出高測序深度保證y-str基因座各等位基因的高概率精確判斷的嚴謹性；3、能夠獲得y-str等位基因間的核苷酸差異信息，由于**重復結構存在差異或擴增區(qū)段內(nèi)存在變異(側翼序列的堿基突變或插入缺失)，序列長度相等的等位基因可能是具有遺傳穩(wěn)定性的完全不同的等位基因，這種y-str序列多態(tài)性是個體識別分析的寶貴資源；4、成本低，通過對每個樣本檢材添加標簽一次可以同時對多個樣本進行平行測序。邁杰轉化醫(yī)學具體包括全套的Leica組織樣本制備系統(tǒng)，Ventana、Leica、DAKO等全自動免疫組化儀。江蘇多組學邁杰轉化醫(yī)學NGS平臺共同合作

    室溫孵育1分鐘。e.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉移上清到新的孔板中。三、第二輪多重PCRa.第二輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，在其5’端加上測序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基，其中根據(jù)目標區(qū)域設計得到的序列長度是20個堿基左右，Tm值設定在60℃，多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’。配置PCR總體系，按照理論值的125％配制，震蕩混勻，短時離心。b.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-2nd程序運行2個小時。四、PCR產(chǎn)物純化步驟同二，做兩次純化，徹底去除引物二聚體。***次使用28uL的磁珠純化，用20uL的NFW洗脫；第二次用20uL的磁珠純化，用25uL的NFW洗脫。五、電泳鑒定每個樣品取5uL，進行％的瓊脂糖電泳，觀察是否有條帶，以及條帶長度是否在300-400bp之間。實施例5.文庫定量與混合a.將標準品、熒光定量試劑、引物從-20℃取出放置于冰上融化。b.樣品稀釋10000倍，分兩次梯度稀釋。***次取文庫原液2uL，加入198uL的NFW，振蕩混勻或者用***吹打混勻，短時離心。再從中取出10uL，加入990uLNFW，振蕩混勻或者用***吹打混勻，短時離心。福建專注邁杰轉化醫(yī)學NGS平臺鄭重承諾邁杰轉化醫(yī)學為創(chuàng)新藥企開展全球多中心臨床試驗研究，提供中心實驗室檢測及伴隨診斷開發(fā)服務。

    下游的引物IP用于第二輪多重PCR。具體的建庫過程是：步驟1，將樣本DNA進行片段化處理，隨后每個片段兩端加上特殊的接頭；步驟2，加入***輪擴增的上游引物混合池，與特殊接頭互補的通用引物，配制成PCR總體系，進行***輪擴增；步驟3，將***輪PCR產(chǎn)物純化后，加入第二輪擴增的下游引物混合池，與第二步中使用過的特殊接頭互補的通用引物配制成PCR總體系，進行第二輪擴增；步驟4，將第二輪PCR產(chǎn)物純化后，配置反應總體系，進行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測序。上述技術方案中，作為推薦，步驟2中，***輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，共20個左右的堿基，Tm值設定在60℃，序列根據(jù)目標區(qū)域設計得到，多個引物混成一個OP引物池做為***輪PCR的上游引物。PCR總體系為：2倍PCRMix35uL，10umol/LP71uL，1umol/LOP1uL或OP2uL，DNA25uL。上述技術方案中，作為推薦，步驟3中，第二輪特異性引物是普通的PCR擴增引物，在其5’端加上測序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個左右的堿基，其中根據(jù)目標區(qū)域設計得到的序列長度是20個堿基左右，Tm值設定在60℃，多個引物混成一個IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。

    實施例3、實施例1制備的試劑盒的準確性驗證1、取1ng標準品2800m、樣本一、樣本二或樣本三(見實施例2中步驟二)，按照yfilerpluspcramplifcationkit(thermofisherscientific)的說明書步驟進行毛細管電泳檢測，得到各個基因座的等位基因基因型。分型結果見表4。表4注：m為毛細管電泳檢測技術的分型結果，e為二代測序技術的分型結果。2、按照實施例2中步驟一的方法檢測標準品2800m、樣本一、樣本二或樣本三，得到各個基因座的等位基因基因型。分型結果見表4。結果表明，實施例1制備的試劑盒與yfilerpluspcramplifcationkit重合的基因座，在標準品2800m、樣本一、樣本二和樣本三中的分型結果完全一致。實施例4、實施例1制備的試劑盒中引物具有不可替換性實施例1制備的試劑盒是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗獲得的，主要包括擴增各個基因座引物的反復調(diào)試和引物濃度的摸索。由于復合的基因座數(shù)目較多，引物間相互抑制情況復雜，所以試劑盒中用于擴增各個基因座的引物不可替換。1、設計并合成表5中第2列所示的、用于擴增65個str基因座的引物，然后混合，獲得引物混合物1。設計并合成表5中第4列所示的、用于擴增66個str基因座的引物，然后混合，獲得引物混合物2。邁杰轉化醫(yī)學擁有專業(yè)的病理醫(yī)生提供相應的閱片或遠程病理閱片服務。

    二、一代測序簡介1、發(fā)生和發(fā)展***代測序技術是Sanger于20世紀70年代中末期發(fā)明的雙脫氧鏈終止測序法，手動測序，用同位素標記，Sanger也因此獲得其第2個諾貝爾獎（在Sanger發(fā)明雙脫氧鏈終止測序法前WalterGilbert發(fā)明化學降解法測定DNA序列）；80年代出現(xiàn)***臺自動化測序設備，熒光標記代替同位素，計算機圖像識別；90年代中期測序儀重大改進，毛細管電泳替代凝膠電泳；2003年完成人類基因組測序工作。2、基本原理以單條DNA鏈為模板合成互補鏈，在DNA復制過程中，合成原料（2’脫氧核苷酸dNTP）中摻入標記過的2’3’ddNTP（雙脫氧鏈終止測序法由此而來），就會產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長度分辨。不同末端終止DNA鏈的長度是由摻入到新合成鏈上隨機位置的ddNTP決定的。經(jīng)PCR擴增反應，可以得到一系列長度不同的產(chǎn)物，由于ddNTP帶有熒光標記，對產(chǎn)物進行電泳分離，并用相應的儀器進行檢測，就可以讀出模板的序列。鏈終止法反應的**仍是PCR法。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權歸作者所有。商業(yè)轉載請聯(lián)系作者獲得授權，非商業(yè)轉載請注明出處。 邁杰中心實驗室設有SLAN 96P、Rotor-Gene Q、ABI 7500、ABI ViiA7、Roche z480等實時熒光定量PCR儀及數(shù)字PCR儀！重慶多組學邁杰轉化醫(yī)學NGS平臺值得推薦

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    ABI/SOLiDSOLiD技術是由連接酶測序法發(fā)展而來，LerroyHood在上世紀80年代中期利用連接酶法設計了***臺自動熒光測序儀。SOLiD以四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應，可對單拷貝DN**段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序。Illumina/SolexaIllumina公司的第二代測序儀**早由Solexa公司研發(fā)，其同樣為邊合成邊測序，該技術在測序的過程中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，因為dNTP的3'羥基末端帶有可化學切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基，此時，用激光掃描反應板表面，根據(jù)dNTP所帶的熒光讀取每條模板序列每一輪反應所聚合上去的核苷酸種類，經(jīng)過“合成-清洗-拍照”的循環(huán)過程，**終得到目的片段的堿基排列順序。技術原理Roche/454Roche/454技術原理，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構建單鏈DNA文庫。，將包含PCR所有反應成分的水溶液注入高速旋轉的礦物油表面，形成被礦物油包裹的無數(shù)個小水滴，每一個小水滴即為一個**的PCR反應空間，理想狀態(tài)下，每一個小水滴只包含一個DNA模板和一個磁珠，磁珠表面含有與接頭互補的DNA序列，經(jīng)過PCR擴增后。 江蘇多組學邁杰轉化醫(yī)學NGS平臺共同合作