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    三代測序簡介1、HelicoBioScience2008年4月，HelicoBioScience報道了單分子測序技術(shù)，讀取單分子熒光的能力，是***家商業(yè)化單分子測序技術(shù)的公司，但儀器過于較貴，數(shù)據(jù)質(zhì)量較差，于2010年停止運(yùn)營。2、PacificBiosciences單分子實(shí)時技術(shù)（singlemoleculerealtime,SMRT）利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在聚合反應(yīng)的同時就可以讀取測序產(chǎn)物，在測序速度、讀長和成本方面有著巨大的優(yōu)勢和潛力，但目前讀取速度偏低。以對單分子DNA進(jìn)行非PCR測序為主要特征（二代測序平臺基于PCR擴(kuò)增的信號放大過程），長讀長，實(shí)時，單分子等，但三代測序基于單分子酶學(xué)或者單分子電學(xué)，信號容易丟失，通量不高，單堿基的測序成本也居高不下。目前主要有RSII和sequel兩款測序儀。3、納米孔測序OxfordNanopore：納米孔測序的原理可以簡單地描述為：單個堿基通過納米尺度的通道時，會引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化。理論上，A、C、G、T四種不同的堿基由于化學(xué)性質(zhì)的差異，它們穿越納米孔時引起的電學(xué)參數(shù)變化量也有差異，檢測這些變化量，即可得到相應(yīng)堿基的類型。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)擁有專業(yè)的病理醫(yī)生提供相應(yīng)的閱片或遠(yuǎn)程病理閱片服務(wù)。河北專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺值得推薦

    pcrpurificationkit為德國qiagen公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為y5-28006。。qubittmdsdnahsassaykit為thermofisher公司的產(chǎn)品，貨號為q32854。truseqdnapcr-freehtlibraryprepkit為illumina公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為fc-121-3003。kapalibraryquantificationkit為kapa公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為kk4824。miseqreagentkitv3-600cycles測序試劑為illumina公司的產(chǎn)品，貨號為ms-102-3003。miseqfgx二代測序儀為illumina公司的產(chǎn)品。實(shí)施例1、基于二代測序技術(shù)檢測68個基因座的試劑盒的制備一、68個基因座的篩選本發(fā)明的發(fā)明人通過查閱文獻(xiàn)和現(xiàn)有二代測序str分型產(chǎn)品獲得大量候選的y-str基因座，然后根據(jù)中國人群str群體遺傳多態(tài)性分析結(jié)果，**終篩選獲得68個基因座，包括67個y-str基因座和1個性別決定amelogenin基因座。黑龍江多靶點(diǎn)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺創(chuàng)新服務(wù)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與全球品牌藥企廣f泛展開伴隨診斷產(chǎn)品的開發(fā)合作，已有多個診斷產(chǎn)品上市。

    1、文庫把DNA樣本片段化或篩分成指定長度的目標(biāo)序列，再加上寡核苷酸接頭（和條形碼DN**段的大小是NGS文庫構(gòu)建的主要因素。片段化可以通過不同的方法，比如PCR擴(kuò)增法。（NGS實(shí)驗流程相對復(fù)雜，在過程中會應(yīng)用到PCR擴(kuò)增技術(shù)）），用于后續(xù)測序上機(jī)。2、讀長被片段化后的DNA鏈長度，二代測序通常是100-200bp（bp是雙鏈DNA堿基對單位）。3、通量一次測序上機(jī)可以運(yùn)行的樣本（基因）數(shù)量。4、測序深度一個基因片段被掃描的次數(shù)，測序深度深可提高低頻突變檢出率和檢測準(zhǔn)確率。5、全基因組測序一種生物的全部基因序列的測序，人的基因組序列約3G，基因組是一個細(xì)胞或者生物體所攜帶的全部遺傳信息。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請注明出處。

    套峰細(xì)分的話有如下幾種情形:全雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒中含有多個引物結(jié)合位點(diǎn)；如樣品為PCR產(chǎn)物，則含有非特異性擴(kuò)增。前端雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則其含有多個引物結(jié)合位點(diǎn)，并且其中一套模板出現(xiàn)測序中斷的現(xiàn)象；如樣品為PCR產(chǎn)物，則PCR產(chǎn)物中含有多個引物結(jié)合位點(diǎn)，或者PCR產(chǎn)物中含有引物二聚體等小片段污染。中間雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒并非單克?。蝗鐦悠窞镻CR產(chǎn)物，則部分產(chǎn)物中具有堿基缺失現(xiàn)象，或目的基因為等位基因?qū)е翽CR產(chǎn)物自身不純。后端雙峰：如樣品為克隆后質(zhì)粒，則質(zhì)粒并非單克??；如樣品為PCR產(chǎn)物，則部分產(chǎn)物中具有堿基缺失現(xiàn)象。解決辦法：針對二聚體及小片段干擾的情況，可以使用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物；針對含有多個引物結(jié)合位點(diǎn)的情況，應(yīng)當(dāng)更換測序引物；針對PCR產(chǎn)物出現(xiàn)堿基缺失的情況，可以使用克隆后測序以排除堿基缺失的產(chǎn)物；針對非單克隆的情況，應(yīng)在確認(rèn)克隆無誤的前提下重新挑取單克隆進(jìn)行測序；針對PCR產(chǎn)物含有非特異性擴(kuò)增的情況，應(yīng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件去除非特異性擴(kuò)增，重新制備樣品測序；針對等位基因具有雙模板的情況，應(yīng)當(dāng)采用克隆測序以保證單次測序樣品序列一致。 邁杰基于基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、細(xì)胞組學(xué)及病理組學(xué)等綜合性轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺，豐富的伴隨診斷開發(fā)經(jīng)驗。

    第三代測序技術(shù)以PacBio公司的SMRT技術(shù)和OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔單分子技術(shù)為**的新一代測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù)，與前兩代測序技術(shù)相比，其比較大的特點(diǎn)就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且理論上可以測定無限長度的核酸序列。PacBio技術(shù)平臺SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片，將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部。熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)，當(dāng)一個dNTP被添加到合成鏈上的同時，它會進(jìn)入ZMW孔的熒光信號檢測區(qū)，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類，從而獲得核酸的堿基序列信息。ZMW孔PacBio平臺測序原理每個ZWM孔只允許一條DNA模板進(jìn)入，DNA模板進(jìn)入后，DNA聚合酶與模板結(jié)合，加入4種不同顏色熒光標(biāo)記4種dNTP，其通過布朗運(yùn)動隨機(jī)進(jìn)入檢測區(qū)域并與聚合酶結(jié)合從而延伸模板，與模板匹配的堿基生成化學(xué)鍵的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于其他堿基停留的時間，因此統(tǒng)計熒光信號存在時間的長短，可區(qū)分匹配的堿基與游離堿基。通過統(tǒng)計4種熒光信號與時間的關(guān)系，即可測定DNA模板序列。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)有多年的藥企服務(wù)經(jīng)驗，緊跟藥物研發(fā)趨勢，熟悉新藥研發(fā)動向。山西多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺推薦咨詢

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    吸棄上清。f.每孔加入100uL80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。短時離心，吸棄上清。g.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入30uLNFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。h.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉(zhuǎn)移上清到新的孔板中。實(shí)施例3.多重PCR一、***輪多重PCRa.按照QubitdsDNAHSAssayKit操作手冊檢測樣品濃度，根據(jù)Qubit檢測的樣本濃度，每個樣品取同樣的量(10ng)，每5～10個樣本混合在一起轉(zhuǎn)移到新的孔板中。b.***輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計得到，多個引物混成一個OP引物池做為***輪PCR的上游引物。配置PCR總體系,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時離心。c.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-1st程序運(yùn)行2個小時。二、PCR產(chǎn)物純化，取下孔板，打開蓋子，每孔加入60uL的磁珠，吹打混勻，室溫下孵育5分鐘。b.將孔板或八聯(lián)管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。c.每孔加入100uL80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。d.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開磁力架，每孔加入20uLNFW，吹打混勻重懸磁珠。河北專業(yè)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺值得推薦