吉林一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于二代測序技術(shù)檢測68個(gè)基因座的試劑盒及其使用的引物組合，尤其涉及基于二代測序技術(shù)檢測67個(gè)y-str基因座和amelogenin基因座的試劑盒及其使用的引物組合。背景技術(shù)：短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat，str)是由2～6bp重復(fù)單位串聯(lián)組成且***存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的dna序列，是目前法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定應(yīng)用*****的遺傳標(biāo)記。人類y染色體短串聯(lián)重復(fù)(y-chromosomeshorttandemrepeats，y-str)具有父系遺傳、缺乏重組、分型簡單、信息量大、多態(tài)性高等特點(diǎn)，是研究人類的起源進(jìn)化、民族差異、種族差異、群體及地區(qū)分布等的有力工具。因此，y染色體str基因座多態(tài)性研究可為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定提供重要手段，在諸如父系家族的親權(quán)鑒定、混合斑男性成分的檢測、不同男性個(gè)體混合物的分析、追溯父系遷移歷史及重構(gòu)同一父系家族等方向都具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。目前，熒光標(biāo)記多重?cái)U(kuò)增結(jié)合毛細(xì)管電泳(fluorescentlabeledmultiplexpcr-capillaryelectrophoresis，pcr-ce)是str分型的主流技術(shù)；常用的商業(yè)化y-str分型試劑盒有y23(promega)、y(promega)、yfiler(thermofisherscientific)和yfilerplus。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)設(shè)有病原體檢測平臺(tái)Qiastat-Dx進(jìn)行呼吸道及胃腸道病原體檢測。吉林一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    其中擴(kuò)增dys19、dys388、dys389i、dys389ii、dys392、dys449、dys459a/b、dys485、dys504、dys531、dys626和dys627的引物不同。表52、取標(biāo)準(zhǔn)品2800m，用超純水稀釋，獲得濃度為1ng/μl的標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液。3、以標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液為模板，分別采用引物混合物1和引物混合物2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。每條引物在反應(yīng)體系的濃度均為μm。4、同實(shí)施例2步驟一中3。5、同實(shí)施例2步驟一中4。6、同實(shí)施例2步驟一中5。檢測結(jié)果見表6。結(jié)果表明，實(shí)施例1制備的試劑盒中的引物被替換后，部分基因座被抑制且引物混合物1和引物混合物2的抑制情況不同。表6注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目；“-”表示未獲得基因型。上述結(jié)果表明，實(shí)施例1制備的試劑盒中引物具有不可替換性，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)摸索，才獲得了試劑盒中的引物組合及引物濃度。湖南專注邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)技術(shù)指導(dǎo)邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)利用新一代智能技術(shù)補(bǔ)充傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的檢測模式，賦能醫(yī)療健康建設(shè)，更好地為臨床和患者服務(wù)。

    1、文庫把DNA樣本片段化或篩分成指定長度的目標(biāo)序列，再加上寡核苷酸接頭（和條形碼DN**段的大小是NGS文庫構(gòu)建的主要因素。片段化可以通過不同的方法，比如PCR擴(kuò)增法。（NGS實(shí)驗(yàn)流程相對復(fù)雜，在過程中會(huì)應(yīng)用到PCR擴(kuò)增技術(shù)）），用于后續(xù)測序上機(jī)。2、讀長被片段化后的DNA鏈長度，二代測序通常是100-200bp（bp是雙鏈DNA堿基對單位）。3、通量一次測序上機(jī)可以運(yùn)行的樣本（基因）數(shù)量。4、測序深度一個(gè)基因片段被掃描的次數(shù)，測序深度深可提高低頻突變檢出率和檢測準(zhǔn)確率。5、全基因組測序一種生物的全部基因序列的測序，人的基因組序列約3G，基因組是一個(gè)細(xì)胞或者生物體所攜帶的全部遺傳信息。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請注明出處。

    ⑦側(cè)翼序列堿基數(shù)，各部分之間用tab鍵隔開。按照這種格式依次對68個(gè)基因座進(jìn)行錄入。68個(gè)基因座基因配置文件錄入完成后，運(yùn)行***。該文件給出了①基因座名稱，②基因分型，③擴(kuò)增子堿基數(shù)，④擴(kuò)增子序列信息，⑤測序深度五個(gè)部分。根據(jù)國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)(internationalsocietyforforensicgenetics，isfg)發(fā)表的關(guān)于y-str基因座的str序列指南()和niststr數(shù)據(jù)庫(strbase.)y染色體str情況說明對67個(gè)y-str基因座的序列構(gòu)建**重復(fù)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品2800m得到了完整的str分型，完全能夠滿足法醫(yī)str檢驗(yàn)的要求。表3-1注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目。表3-2注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目。二、采用實(shí)施例1制備的試劑盒的應(yīng)用——口腔拭子樣本的基因座分型樣本一、樣本二和樣本三為3名漢族男性無關(guān)個(gè)體的口腔拭子的基因組dna，濃度均為1ng/μl。3名漢族男性均知情同意。將步驟一中的標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液替換為樣本一、樣本二或樣本三，其它步驟均不變。檢測結(jié)果見表3。結(jié)果表明，樣本一、樣本二和樣本三均獲得了完整的str分型結(jié)果。邁杰與大學(xué)，研究院所，醫(yī)院的科研人員進(jìn)行科研轉(zhuǎn)化研究合作,包括基礎(chǔ)科學(xué)研究及臨床應(yīng)用研究等。

    3、主要平臺(tái)提供方ABI公司三、二代測序簡介1、Roche454測序:454測序是大規(guī)模平行測序的開始。2003年底，454公司推出了基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)—(GS)。2005年454公司被羅氏診斷公司收購，之后優(yōu)化推出GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。羅森博格博士是該技術(shù)的創(chuàng)始人,也是IonTorrent平臺(tái)的創(chuàng)始人。454平臺(tái)的突出優(yōu)勢是長讀長(400nt)，但準(zhǔn)確率低，成本高。是高通量測序的過渡。454測序技術(shù)的具體步驟為：（1）構(gòu)建測序文庫。將基因組DNA打碎成300～800個(gè)堿基片段后，在兩端加上錨定接頭；（2）PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)生成千上萬個(gè)拷貝；（3）焦磷酸測序。復(fù)制過程中如果發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，就會(huì)釋放1個(gè)焦磷酸，在一系列酶的催化下，釋放出熒光信號(hào)，會(huì)被CCD捕獲到。每個(gè)堿基反應(yīng)都會(huì)捕獲到1個(gè)熒光信號(hào)，由此一一對應(yīng)，模板的堿基序列由此獲得。作者：心平氣和鏈接：源：知乎著作權(quán)歸作者所有。商業(yè)轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請注明出處。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為全球合作伙伴提供包括生物標(biāo)記物挖掘、藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證、伴隨診斷開發(fā)等一體化解決方案。吉林多基因聯(lián)合檢測邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)技術(shù)指導(dǎo)

邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)具有多年伴隨診斷服務(wù)經(jīng)驗(yàn),獲得CNAS國際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可,美國CAP認(rèn)證。吉林一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦

    反應(yīng)體系為20μl，由10μl2×mastermix(德國qiagen公司)、1μl標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液、引物混合物和無核酶水組成。該反應(yīng)體系中，各個(gè)引物的濃度見表1中第5列。反應(yīng)程序：95℃5min；95℃30s，60℃2min，72℃2min，28個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。3、純化和定量(1)取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，按照pcrpurificationkit的說明書步驟進(jìn)行純化，得到pcr純化產(chǎn)物。(2)將pcr純化產(chǎn)物按照qubittmdsdnahsassaykit說明書，采用，得到pcr純化產(chǎn)物的濃度。4、文庫制備取pcr純化產(chǎn)物，按照truseqdnapcr-freehtlibraryprepkit的說明書操作步驟依次進(jìn)行末端修復(fù)、末端修復(fù)產(chǎn)物純化、連接a-tail、連接adapter和連接產(chǎn)物的純化，然后按照kapalibraryquantificationkit的說明書步驟進(jìn)行文庫定量及文庫標(biāo)準(zhǔn)化，完成文庫制備。5、上樣測試取步驟4制備的文庫，使用miseqreagentkitv3-600cycles測序試劑于miseqfgx二代測序儀上進(jìn)行測序。6、數(shù)據(jù)分析測序結(jié)束后儀器自動(dòng)生成fastq文件，使用。運(yùn)行，在notepad中錄入68個(gè)基因座基因配置文件。基因座基因配置文件如下：①基因座名稱，②y，③正向引物后12個(gè)堿基，④反向引物前12個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列，⑤該基因座**序列的兩個(gè)重復(fù)單元，⑥一個(gè)重復(fù)單元的堿基數(shù)。吉林一體化邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺(tái)值得推薦