黑龍江多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺來電咨詢

    ABI/SOLiDSOLiD技術(shù)是由連接酶測序法發(fā)展而來，LerroyHood在上世紀(jì)80年代中期利用連接酶法設(shè)計了***臺自動熒光測序儀。SOLiD以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對單拷貝DN**段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測序。Illumina/SolexaIllumina公司的第二代測序儀**早由Solexa公司研發(fā)，其同樣為邊合成邊測序，該技術(shù)在測序的過程中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，因為dNTP的3'羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基，此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，根據(jù)dNTP所帶的熒光讀取每條模板序列每一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類，經(jīng)過“合成-清洗-拍照”的循環(huán)過程，**終得到目的片段的堿基排列順序。技術(shù)原理Roche/454Roche/454技術(shù)原理，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，形成被礦物油包裹的無數(shù)個小水滴，每一個小水滴即為一個**的PCR反應(yīng)空間，理想狀態(tài)下，每一個小水滴只包含一個DNA模板和一個磁珠，磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)致力于解決創(chuàng)新藥物的研發(fā)痛點及患者的用藥痛點，助力精z準(zhǔn)醫(yī)療！黑龍江多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺來電咨詢

    用聚合酶和外切核酸酶把DN**段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核苷酸黏性末端。然后將測序接頭與片段連接；2)簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測序循環(huán)。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DN**段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段；3)測序，DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下一個循環(huán)開始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解；4)數(shù)據(jù)分析，測序得到的原始數(shù)據(jù)是長度為幾十個堿基的序列，要通過生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。聚合酶鏈反應(yīng)(即PCR)是一種***運(yùn)用于分子遺傳和診斷的技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DN**段，可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，可分析任何短的DNA序列，PCR的**大特點，是能將微量的DNA大幅增加，即使樣品中只含有低水平的DNA。PCR技術(shù)可用于擴(kuò)增分析用的DNA或RNA選定片段。黑龍江多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺來電咨詢邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為生物標(biāo)志物研究和伴隨診斷開發(fā)提供科學(xué)支持，多層面助力新藥研發(fā)臨床試驗。

    PacBio平臺技術(shù)關(guān)鍵DNA聚合酶，該技術(shù)得到的序列讀長主要跟DNA聚合酶的活性有關(guān)，它主要受激光對其造成的損傷所影響。熒光基團(tuán)標(biāo)記在核苷酸3'端磷酸上，在DNA合成過程中，3'端的磷酸鍵隨著DNA鏈的延伸被斷開，標(biāo)記物被棄去，減少了DNA合成的空間位阻，維持DNA鏈連續(xù)合成，延長了測序讀長。ZMW(零模波導(dǎo)孔)，將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景進(jìn)行區(qū)分，在一個反應(yīng)管中有許多這樣的圓形納米小孔，其外徑*有100nm，激光從底部打出后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個小范圍里，使得熒光信號*來自這個小反應(yīng)區(qū)域，孔外其它游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實現(xiàn)將背景熒光降到比較低。PacBio平臺技術(shù)優(yōu)勢1.近乎完美的一致性和準(zhǔn)確性三代測序單堿基錯誤率雖然很高，但是這種單堿基的錯誤是隨機(jī)發(fā)生的，因此，對同一段序列測序覆蓋多次就能夠進(jìn)行糾錯，一般覆蓋到10X以上的深度就能達(dá)到。2.不存在測序的偏好性因為SMRT技術(shù)在樣本制備時無需PCR擴(kuò)增，對于某些具有極端的堿基組成的核酸區(qū)域，三代測序也是無偏好性的，同時也不受回文序列的影響。3.序列準(zhǔn)確比對二代測序得到的序列由于長度不夠，在進(jìn)行比對時，會出現(xiàn)很多錯誤匹配，從而造成假陽性SNP位點。

    h1)str分型；(h2)y-str分型；(h3)個體識別；(h4)親權(quán)鑒定；(h5)種族推斷。本發(fā)明還保護(hù)上述任一所述引物組合或上述任一所述復(fù)合擴(kuò)增體系的應(yīng)用，可為(h1)-(h5)中的至少一種：(h1)str分型；(h2)y-str分型；(h3)個體識別；(h4)親權(quán)鑒定；(h5)種族推斷。上述任一所述68個基因座具體可由amelogenin、dys19、dys385a/b、dyf387s1a/b、dys388、dys389-i、dys389-ii、dys390、dys391、dys392、dys393、dyf399s1、dyf404s1a/b、dys437、dys438、dys439、dys443、dys444、dys446、dys447、dys448、dys449、dys456、dys458、dys459a/b、dys460、dys481、dys485、dys504、dys505、dys508、dys510、dys518、dys520、dys522、dys527a/b、dys531、dys533、dys549、dys552、dys557、dys570、dys576、dys587、dys593、dys596、dys612、dys617、dys622、dys626、dys627、dys630、dys635、dys641、dys643、dys644、dys645、dys710、dys720、y-gata-a10和y-gata-h4組成。其中，amelogenin為性別決定基因座。dyf399s1包含三個分型片段。dys385a/b、dyf387s1a/b、dyf404s1a/b、dys459a/b和dys527a/b均包含兩個分型片段。本發(fā)明提供的試劑盒可以檢測68個基因座。覆蓋多個主流IHC自動染色平臺，適用范圍廣。

    反應(yīng)體系為20μl，由10μl2×mastermix(德國qiagen公司)、1μl標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液、引物混合物和無核酶水組成。該反應(yīng)體系中，各個引物的濃度見表1中第5列。反應(yīng)程序：95℃5min；95℃30s，60℃2min，72℃2min，28個循環(huán)；72℃5min；4℃保存。3、純化和定量(1)取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，按照pcrpurificationkit的說明書步驟進(jìn)行純化，得到pcr純化產(chǎn)物。(2)將pcr純化產(chǎn)物按照qubittmdsdnahsassaykit說明書，采用，得到pcr純化產(chǎn)物的濃度。4、文庫制備取pcr純化產(chǎn)物，按照truseqdnapcr-freehtlibraryprepkit的說明書操作步驟依次進(jìn)行末端修復(fù)、末端修復(fù)產(chǎn)物純化、連接a-tail、連接adapter和連接產(chǎn)物的純化，然后按照kapalibraryquantificationkit的說明書步驟進(jìn)行文庫定量及文庫標(biāo)準(zhǔn)化，完成文庫制備。5、上樣測試取步驟4制備的文庫，使用miseqreagentkitv3-600cycles測序試劑于miseqfgx二代測序儀上進(jìn)行測序。6、數(shù)據(jù)分析測序結(jié)束后儀器自動生成fastq文件，使用。運(yùn)行，在notepad中錄入68個基因座基因配置文件?；蜃蚺渲梦募缦拢孩倩蜃Q，②y，③正向引物后12個堿基，④反向引物前12個堿基的反向互補(bǔ)序列，⑤該基因座**序列的兩個重復(fù)單元，⑥一個重復(fù)單元的堿基數(shù)。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)分子平臺可以基于成熟的qPCR技術(shù)定量檢測外源載體拷貝數(shù)，應(yīng)用于藥物分布實驗如CAR-T等。上海全平臺邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺來電咨詢

方法簡單易行，醫(yī)保覆蓋，適于臨床推廣。黑龍江多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺來電咨詢

    同時操作更為簡單，整個上機(jī)測序可在（文庫構(gòu)建時間除外）。其劣勢在于芯片的通量并不高，非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。小結(jié)：二代測序相比一代測序大幅降低了成本，保持了較高準(zhǔn)確性，并且大幅降低了測序時間，將一個人類基因組從3年降為1周以內(nèi)，但在序列讀長方面比起***代測序技術(shù)則要短很多，這也給三代測序提供了發(fā)展空間。三、獨辟蹊徑補(bǔ)空缺三代測序：單分子測序背景：測序技術(shù)經(jīng)過***代、第二代的發(fā)展，讀長從一代測序的近1000bp，降到了二代測序的幾百bp，通量和速度大幅提升，那么第三代測序的發(fā)展思路在于保持二代測序的速度和通量優(yōu)勢同時，彌補(bǔ)其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比，**大的特點就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1、Oxfordnanopore納米孔+電流檢測技術(shù)原理：該技術(shù)設(shè)計了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭，**終得到電信號而不是光信號或pH信號的測序技術(shù)。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時，電荷將發(fā)生變化，因而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。優(yōu)勢劣勢：①讀長很長，大約在幾十kb，甚至100kb；②錯誤率目前相比較高。黑龍江多靶點邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺來電咨詢