山西組織標(biāo)本邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺共同合作

    ***代測序技術(shù)1975年由FrederickSanger所提出的鏈終止法以及1977年由WalterGibert所發(fā)明的鏈降解法被稱為***代測序技術(shù)。1977年，WalterGilbert和FrederickSanger發(fā)明了***臺測序儀，并應(yīng)用其測定了***個基因組序列，噬菌體X174，全長5375個堿基。WalterGilbert和FrederickSanger也因在測序技術(shù)中的貢獻(xiàn)獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎。技術(shù)原理目前，基于***代測序技術(shù)的測序儀幾乎都是采用Sanger提出的鏈終止法。鏈終止法測序的**原理是ddNTP的2'和3'端都不含羥基，因此在合成核酸鏈的過程中無法形成磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致DNA合成反應(yīng)中斷。在測定待測核酸片段的序列時，向反應(yīng)體系中加入一定比例的帶有放射性同位素標(biāo)記的4種ddNTP，利用DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待測核酸模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止，**終會得到一組長度各相差一個堿基的鏈終止產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可通過高分辨率變性凝膠電泳分離并根據(jù)其長度排序，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影進(jìn)行檢測，從而確定目的核酸片段各個位置的堿基。完整的測序過程分為4步：：如要利用Sanger測序方法進(jìn)行完整基因組的測定，首先要將提取得到的樣品完整DNA打碎，形成DN**段，如只是測定單個目的基因的序列。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)獲得了歐盟ISO 13485質(zhì)量認(rèn)證并通過了國家醫(yī)療器械GMP稽查。山西組織標(biāo)本邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺共同合作

    ，需將磁珠固定在特制的PTP平板上。這種平板上含有許多直徑約為44μm的小孔，每個小孔*能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置。啟動測序反應(yīng)后，每次向PTP平板中加入一種dNTP，如果能與待測序列配對，則會在堿基連接在模板上之后釋放焦磷酸，焦磷酸通過ATP硫酸化學(xué)酶***熒光素酶產(chǎn)生熒光，通過PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄熒光，從而確定目的模板的核酸序列。ABI/SOLiDABI/SOLiD技術(shù)原理SOLiD測序技術(shù)與454技術(shù)的原理比較類似，同樣是采用油包水的方式進(jìn)行EmulsionPCR。不同之處在于SOLiD形成的小水滴要比454系統(tǒng)小得多，只有1μm大小，并且在PCR擴(kuò)增的同時對擴(kuò)增產(chǎn)物的3'端進(jìn)行修飾，為下一步的測序做準(zhǔn)備。在PCR完成之后，SOLiD技術(shù)進(jìn)行測序時，其反應(yīng)底物不是dNTP也不是ddNTP，而含有8個堿基的單鏈熒光探針混合物，在測序時，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對，不同的探針的5'末端分別標(biāo)記不同顏色的熒光染料，每兩個堿基確定一個熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基，因此，這種測序方法也被稱為兩堿基測序法。 福建抗體全邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺口碑推薦邁杰與大學(xué)，研究院所，醫(yī)院的科研人員進(jìn)行科研轉(zhuǎn)化研究合作,包括基礎(chǔ)科學(xué)研究及臨床應(yīng)用研究等。

    ⑦側(cè)翼序列堿基數(shù)，各部分之間用tab鍵隔開。按照這種格式依次對68個基因座進(jìn)行錄入。68個基因座基因配置文件錄入完成后，運(yùn)行***。該文件給出了①基因座名稱，②基因分型，③擴(kuò)增子堿基數(shù)，④擴(kuò)增子序列信息，⑤測序深度五個部分。根據(jù)國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(internationalsocietyforforensicgenetics，isfg)發(fā)表的關(guān)于y-str基因座的str序列指南()和niststr數(shù)據(jù)庫(strbase.)y染色體str情況說明對67個y-str基因座的序列構(gòu)建**重復(fù)結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品2800m得到了完整的str分型，完全能夠滿足法醫(yī)str檢驗的要求。表3-1注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目。表3-2注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目。二、采用實施例1制備的試劑盒的應(yīng)用——口腔拭子樣本的基因座分型樣本一、樣本二和樣本三為3名漢族男性無關(guān)個體的口腔拭子的基因組dna，濃度均為1ng/μl。3名漢族男性均知情同意。將步驟一中的標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液替換為樣本一、樣本二或樣本三，其它步驟均不變。檢測結(jié)果見表3。結(jié)果表明，樣本一、樣本二和樣本三均獲得了完整的str分型結(jié)果。

    二代測序是一個強(qiáng)大的功能平臺，它可以同時給數(shù)以萬計的DNA分子進(jìn)行測序。由于這種可以多個樣本同時測序的能力，在個性化醫(yī)療、遺傳疾病和臨床診斷等方面，二代測序也就是高通量測序開創(chuàng)了**性的領(lǐng)域。早在1900年代就發(fā)明的Sanger測序法，成為了DNA測序的黃金法則，即便到了***它仍被***用來進(jìn)行常規(guī)測序和NGS數(shù)據(jù)的驗證。它利用高保真DNA聚合酶生成與單鏈DNA模版互補(bǔ)的拷貝。在每個反應(yīng)中，一個可以特異性識別模版的單鏈引物，可以從3端開始啟動DNA合成，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，脫氧核糖核苷酸或簡單的核苷酸是一個接一個的與模版配對。每個反應(yīng)還包含四種雙脫氧核糖核苷酸的混合物，每一種對應(yīng)一個DNA堿基。這些雙脫氧核糖核苷酸與DNA單體十分類似，因此可以參與DNA鏈的增長，但是他們和天然的脫氧核糖核苷酸有兩點不同：（1）他們?nèi)鄙僖粋€會影響DNA鏈進(jìn)一步衍生的3’羥基。在DNA延伸過程中，這個3’羥基一旦加入DNA分子中就會導(dǎo)致鏈的終止；（2）每個雙脫氧核糖核苷酸都有獨(dú)特的熒光染料吸附，使得DNA測序的自動檢測得以進(jìn)行。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)建立了符合質(zhì)量體系規(guī)定的覆蓋全平臺的伴隨診斷產(chǎn)品研發(fā)實驗室、質(zhì)檢實驗室，擁有GSP證書。

    于是，每個反應(yīng)會產(chǎn)生許多不同長度的DN**段，并在模版的任一核苷酸位置上由其中一種雙脫氧核糖核苷酸終止鏈的延伸。反應(yīng)混合物可以通過手動灌膠或自動灌膠到用毛細(xì)管進(jìn)入測序機(jī)器，再根據(jù)DNA分子大小不同用電泳分離DNA。當(dāng)DNA流過凝膠后，DNA序列可以通過雙脫氧核糖核苷酸上發(fā)出的熒光來進(jìn)行分析。當(dāng)今的Sanger測序儀使用的是毛細(xì)管自動上樣的凝膠電泳，一般可以同時分析8-96個系列反應(yīng)。二代測序系統(tǒng)在十年前就是因其可同時進(jìn)行大量平行測序反應(yīng)而廣為人知。這些系統(tǒng)可以同時分析百萬甚至上億個序列反應(yīng)。雖然不同的機(jī)器生產(chǎn)時會在技術(shù)細(xì)節(jié)上有許多不同，但他們都有以下幾個共同點：1,文庫建立：所有二代測序的平臺都需要一個基因文庫，這個基因文庫包含通過引申或者連接自定義的接頭序列。2,測序儀器：每個文庫片段在共階吸附的DNA連接因子的作用下，以文庫適配序列為模版，在固體表面上進(jìn)行擴(kuò)增。這步擴(kuò)增會產(chǎn)生許多DNA蔟，每個來源于一個文庫片段，每個基因蔟都會像**的測序反應(yīng)一樣起作用。3,數(shù)據(jù)輸出：每個儀器都會在測序結(jié)束后給出原始數(shù)據(jù)。這個原始數(shù)據(jù)時每個基因蔟中形成的DNA序列的**。 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)目前已完成約30+靶點的方法學(xué)驗證，50+靶點的方法學(xué)建立。湖北全平臺邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺技術(shù)指導(dǎo)

邁杰擁有StarLIMS實驗室信息化管理系統(tǒng)，中心實驗室獲得了中國CNAS ISO 17025實驗室認(rèn)可、美國CAP認(rèn)證。山西組織標(biāo)本邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺共同合作

    其中擴(kuò)增dys19、dys388、dys389i、dys389ii、dys392、dys449、dys459a/b、dys485、dys504、dys531、dys626和dys627的引物不同。表52、取標(biāo)準(zhǔn)品2800m，用超純水稀釋，獲得濃度為1ng/μl的標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液。3、以標(biāo)準(zhǔn)品2800m水溶液為模板，分別采用引物混合物1和引物混合物2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。每條引物在反應(yīng)體系的濃度均為μm。4、同實施例2步驟一中3。5、同實施例2步驟一中4。6、同實施例2步驟一中5。檢測結(jié)果見表6。結(jié)果表明，實施例1制備的試劑盒中的引物被替換后，部分基因座被抑制且引物混合物1和引物混合物2的抑制情況不同。表6注：n與其后數(shù)字表示一段堿基序列，其后數(shù)字表示序列的堿基數(shù)目；“-”表示未獲得基因型。上述結(jié)果表明，實施例1制備的試劑盒中引物具有不可替換性，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗摸索，才獲得了試劑盒中的引物組合及引物濃度。山西組織標(biāo)本邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)NGS平臺共同合作