青海瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究

在這里，Genovis分析了 C1 抑制劑——一種人血漿衍生的生物zhiliao藥物，由 6 種 N-聚糖和多達 28 種 O-聚糖修飾，主要由唾液酸he心 1 結構組成。在不對這種高度異質的蛋白質進行任何預處理的情況下，反相LC-MS分析產生了無法詳細解釋的復雜質譜圖。在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時內有效去除所有O-聚糖。然而，蛋白質上仍殘留著 1 到 3 個 N-聚糖。使用凍干的PNGase F和OmniGLYZOR試劑盒中包含的MS友好型RapiGest? SF表面活性劑*，在變性條件下通過額外的去糖基化步驟去除這些不可接近的N-聚糖。觀察到所有聚糖的完全去除，但分子上存在的少量he心 2 O-聚糖除外。水解O-聚糖的酶不會從變性中獲益，這就是為什么OmniGLYZOR Microspin色譜柱只能在非變性條件下使用的原因。PNGase F酶在大腸桿菌中表達，該重組基因來源于伊麗莎白金氏腦膜敗血癥。青海瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究

FucosEXO中的酶在大腸桿菌中表達，帶有His標簽，分子量為87 kDa和64 kDa。FucosEXO在天然條件下水解糖蛋白上的巖藻糖，在6至8的pH值范圍內顯示出高活性，無需輔助因子或添加劑。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結合酶以提高效率；3. 適用于自動化工作流程；4.即用型 - 只需加水即可。Genovis的FucosEXO 是 α-巖藻糖苷酶的混合物，用于在 N-和 O-糖基化蛋白或游離寡糖上有效水解 α1-2、α1-3 和 α1-4-連接的巖藻糖。人血清中 O-糖蛋白的富集：GlycOCATCH還可用于從復雜的樣品混合物（如人血清）中選擇性富集O-糖基化蛋白。簡而言之，用Genovis的SialEXO處理血清并應用于GlycOCATCH樹脂。洗滌樹脂，用8M尿素洗脫O-糖基化蛋白。用胰蛋白酶消化樣品并使用 RP-LC-MS/MS 進行分析，并使用 Swiss Prot 數據庫鑒定蛋白質列表。O-糖基化蛋白以黃色表示。青海瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究PNGase F去除N-糖，被用于MS分析的樣品制備，以降低蛋白質的異質性，分析游離的糖，并研究N-糖的功能作用。

Genovis 集團由瑞典 Genovis AB 和美國全資子公司 Genovis Inc. 組成。該公司的在納斯達克北方增長市場上市。如需了解更多信息，請訪問投資者關系。 Genovis的經營理念是為生物制藥和研究行業(yè)的客戶提供工具，以促進和節(jié)省開發(fā)新治療方法和診斷的時間。Genovis 酶產品，稱為 SmartEnzymes，被世界各地的科學家使用，創(chuàng)新的產品形式促進了生物藥物的開發(fā)和質量控制。 通過在2020年收購QED Bioscience，產品組合已擴大到包括用于研究、生物藥物開發(fā)和診斷檢測的抗體和試劑。在 網站 上閱讀有關QED的更多信息 Genovis 研發(fā)活動的基石是客戶關系，使產品開發(fā)能夠滿足客戶需求。與專注于表征新酶、開發(fā)新工作流程和新靶點抗體的學術團體的合作同樣有價值。

在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截斷O-聚糖后，在質譜圖中觀察到幾個與GalNAcs相關的峰。為了去除剩余的GalNAc殘基，應用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO處理后觀察到的單個蛋白峰顯示完全去除剩余的GalNAcs。?GalNAcEXO在生理緩沖液和中性pH值中具有活性，使其與大多數樣品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依賴于任何可能影響LC-MS分析的輔因子，如BSA。根據底物的性質，糖蛋白的GalNAcEXO反應在2小時內完成，而更復雜的樣品可能需要孵育過夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在離心柱中，以便快速方便地處理樣品，在制備過程中不會殘留酶。使用OpeRATOR對胞生成素（EPO）進行O-糖位點特異性消化：確定中級水平的 O-糖基化位點。

我們測量了FucosEXO從一組dai表不同鍵的不同寡糖底物中釋放的巖藻糖。FucosEXO可有效釋放α1-2、α1-3和α1-4連接的巖藻糖，對α1-6連接的巖藻糖殘基沒有活Genovis的FucosEXO的底物特異性：巖藻糖以不同的鍵存在于N-和O-聚糖上。α1-2、α1-3 和 α1-4 連接的巖藻糖常見于 O-聚糖中，并作為 N-聚糖的天線巖藻糖基化，而 α1-6 連接的巖藻糖被發(fā)現是 N-聚糖he心的修飾。β1-3,4半乳糖的水解：Genovis的GalactEXO 是一種β-半乳糖苷酶混合物，可水解 N-和 O-糖基化蛋白中的 β1-3,4-連接末端半乳糖。PNGase F（肽 N-糖苷酶 F）是一種糖酰胺酶，可水解內層 GlcNAc 之間的酰胺鍵。青海瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究

將OglyZOR酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時。青海瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究

蛋白質的N-糖基化特征是一個關鍵的質量屬性。它會影響生物制藥的安全性和有效性，因此需要在開發(fā)和生產過程中進行表征和監(jiān)測。常見的聚糖分析工作流程是用PNGase F釋放N-聚糖，然后用熒光標記物（如2-AB、2-AA、普魯卡因胺或RapiFluor-MS?（沃特世公司））標記生成的聚糖。然后使用HILIC-HPLC或毛細管電泳分離標記的聚糖，以表征和定量不同的聚糖結構。 在這里，使用游離聚糖方法分析zhiliao性抗體曲妥珠單抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白RNase B的N-聚糖。曲妥珠單抗和依那西普在天然條件下在37°C下用Genvois的PNGase F去糖基化1小時，而RNase B需要變性和還原才能完全去糖基化。因此，在50°C下用PNGase F去糖基化10分鐘之前，用RapiGest? SF表面活性劑（沃特世公司）和TCEP處理RNase B。 用RapiFluor-MS標記所得游離的聚糖，并通過HILIC UPLC-FLD-MS進行分析。青海瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶蛋白質組學研究