安徽PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

從依那西普水解β1-3和β1-4半乳糖：Genovis的GalactEXO Immobilized 對 β1-3 和 β1-4 連接的半乳糖均具有酶活性，這些半乳糖存在于裝飾有 N- 和 O-連接糖基化的生物制藥中，例如 Fc-融合蛋白依那西普。將依那西普與GalactEXO固定化孵育60分鐘，并在FabRICATOR消化后使用LC-MS在亞基水平上研究酶活性。TNFR和Fc/2片段分別分析。與GalactEXO Immobilized孵育導(dǎo)致N-連接和O-連接聚糖上的半乳糖殘基水解，這在半乳糖基化物種中被視為信號丟失。對游離的N-聚糖分析證實了LC-MS數(shù)據(jù)。對天然糖蛋白或游離的聚糖結(jié)構(gòu)上存在的 N- 和 O-連接聚糖均具有活性。安徽PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

在這里，Genovis分析了 C1 抑制劑——一種人血漿衍生的生物zhiliao藥物，由 6 種 N-聚糖和多達(dá) 28 種 O-聚糖修飾，主要由唾液酸he心 1 結(jié)構(gòu)組成。在不對這種高度異質(zhì)的蛋白質(zhì)進(jìn)行任何預(yù)處理的情況下，反相LC-MS分析產(chǎn)生了無法詳細(xì)解釋的復(fù)雜質(zhì)譜圖。在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時內(nèi)有效去除所有O-聚糖。然而，蛋白質(zhì)上仍殘留著 1 到 3 個 N-聚糖。使用凍干的PNGase F和OmniGLYZOR試劑盒中包含的MS友好型RapiGest? SF表面活性劑*，在變性條件下通過額外的去糖基化步驟去除這些不可接近的N-聚糖。觀察到所有聚糖的完全去除，但分子上存在的少量he心 2 O-聚糖除外。水解O-聚糖的酶不會從變性中獲益，這就是為什么OmniGLYZOR Microspin色譜柱只能在非變性條件下使用的原因。河北N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶瑞典GenovisFucosEXO酶在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為87 kDa和64 kDa，在6至8的pH值范圍內(nèi)顯示出高活性。

Genovis的SialEXO Immobilized是一種微離心柱，用于在室溫下孵育30分鐘后完全去除0.5mg天然糖蛋白上的唾液酸。為了研究依那西普的潛在電荷變體，開發(fā)了一種使用SialEXO固定化柱對糖蛋白進(jìn)行去唾液酸化的一般工作流程。毛細(xì)管電泳通常用于在生物制劑的表征和質(zhì)量控制過程中確定電荷變體。使用SialEXO Imfixedized對糖蛋白進(jìn)行去唾液酸化，并使用ProteinSimple的Maurice在成像等電聚焦中進(jìn)行分析。綜合起來，該分析工作流程改進(jìn)了糖蛋白的分離并實現(xiàn)了電荷異構(gòu)體分析。依那西普，如果不首先去除唾液酸，將很難分析，但使用SialEXO固定化分離峰可以獲得。

用于水解離心柱中糖蛋白上的N-聚糖的固定化酶。 Genovis的PNGase F 固定化微離心柱含有與瓊脂糖珠共價偶聯(lián)的 PNGase F 酶，用于在樣品中酶峰減少的糖蛋白上水解 N-糖。 將糖蛋白樣品與PNGase F一起在離心柱中固定，然后通過離心步驟輕松收集去糖基化的蛋白質(zhì)。由于空間位阻，PNGase F對某些糖蛋白的活性可能緩慢或受到抑制 - 在這些情況下可能需要更長的孵育時間或糖蛋白變性。 Microspin 色譜柱可用于水解 5 或 10 x 0.2 mg 糖蛋白。1. 易于使用的離心柱；2. 提高酶與底物的比例，提高消化效率；3.z終樣品中的酶峰減少。FucosEXO 是α-巖藻糖苷酶混合物。

Genovis的SialEXO產(chǎn)品是用于去除和分析唾液酸的唾液酸酶。這些酶對天然糖蛋白或游離的聚糖結(jié)構(gòu)上存在的 N- 和 O-連接聚糖均具有活性。SialEXO用于在用OpeRATOR或OglyZOR消化之前預(yù)處理O-糖基化蛋白。其他應(yīng)用包括降低樣品復(fù)雜性、電荷異構(gòu)體分析和外切糖苷酶陣列。N-連接、O-連接和游離聚糖的高效去唾液酸化快速去除唾液酸，增強(qiáng)對蛋白質(zhì)電荷變體的分析可固定在即用型離心柱中。然后可以用FabRICATOR消化所得的去糖基化蛋白，并通過中級質(zhì)譜分析。我們將該工作流程應(yīng)用于依那西普的分析，雖然未經(jīng)處理的TNFR結(jié)構(gòu)域過于復(fù)雜而無法分析，但O-聚糖組成可以在用PNGase F處理后進(jìn)行分離和比較。使用OpeRATOR進(jìn)行O-糖位點定位：OpeRATOR 是一種 O-聚糖特異性蛋白酶。湖北固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

OglyZOR 是一種內(nèi)切糖苷酶用于確認(rèn)O-糖的存在和降低樣品的異質(zhì)性。安徽PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

GalactEXO中的酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。GalactEXO由兩種半乳糖苷酶組成，均帶有His標(biāo)簽，組分的分子量為87 kDa和109 kDa。用于水解糖蛋白上β1-3,4-連接半乳糖的凍干酶。Genovis的GalactEXO 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 單位小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解 β1-3,4-連接的半乳糖。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率； 3. 適用于自動化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可！將混合物加載到GlycOCATCH上，洗滌樹脂，并用8M尿素洗脫結(jié)合的肽。純化后，在RP-LC-MS上分離樣品。數(shù)據(jù)顯示，糖苷酸肽的選擇性純化，攜帶he心1-O-聚糖。IgA 特異性 O-糖肽富集：IgA 抗體包含 N-連接的糖基化和重度 O-糖基化的鉸鏈區(qū)域。胰蛋白酶消化IgA后，將肽和genovis 的SialEXO的混合物加載到GlycOCATCH樹脂上，并用PBS和離心洗滌。用 8 M 尿素洗脫顯示預(yù)期的 O-糖基化鉸鏈肽富集，具有不同程度的糖基化。安徽PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究