實(shí)驗(yàn)流程:1根據(jù)目的基因相關(guān)信息(序列,序列號(hào)等),構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體。2對(duì)于測(cè)序正確的重組質(zhì)粒,提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)du素的重組質(zhì)粒。3使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞,進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn),收集病毒液;4濃縮、純化病毒液。5用高質(zhì)量的病毒液感ran細(xì)胞。6通過(guò)定量PCR精確測(cè)定病毒滴度(高精確滴定方法)和Western 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。7用高質(zhì)量的病毒液感ran宿主細(xì)胞;檢測(cè)基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選,通常狀況下,篩選的細(xì)胞克隆株具有長(zhǎng)期的表達(dá)穩(wěn)定性。bing毒液足夠用于一般的動(dòng)物活ti實(shí)驗(yàn)。CCK-8試劑盒可以用于生物活性因子的活性檢測(cè),抗**藥物的篩選,細(xì)胞增值的測(cè)定。內(nèi)切酶
CCK-8試劑(Cell Counting Kit-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑 [1] )中含有WST–8:化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(Formazan),生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣fan用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗**藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。人活化凝血因子elisa試劑盒以GFP作為標(biāo)記的質(zhì)??商娲股鷖u的作用,可以幫助識(shí)別哪些細(xì)胞成功地轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒。
細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞分裂引起的細(xì)胞數(shù)量增加,在整個(gè)生命周期中對(duì)正常組織發(fā)育和維持是必須的。一些類型的細(xì)胞會(huì)處于持續(xù)增殖狀態(tài),如皮膚和骨髓細(xì)胞,但許多成人組織中的細(xì)胞會(huì)處于非增殖狀態(tài),只有在損傷或感ran時(shí),才能被激huo來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞。與之相反,細(xì)胞周期關(guān)鍵基因突變引起的細(xì)胞增殖失調(diào)是各類cancer的標(biāo)志,會(huì)造成**異常的不受控制的生長(zhǎng)。增殖檢測(cè)一般用于分析分裂中的細(xì)胞數(shù)量的變化,進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及活性,細(xì)胞增殖檢測(cè)是細(xì)胞分析和藥物研發(fā)中經(jīng)常會(huì)使用的手段。目前廣泛應(yīng)用于**生物學(xué),分子生物學(xué),藥代動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。
慢病毒(Lentivirus)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,它能夠?qū)谢驅(qū)氲揭恍┹^難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,如原代細(xì)胞等,并且將靶基因隨機(jī)整合到宿主的基因組中,從而大da增加了轉(zhuǎn)染效率,并且能夠在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)若干代,可以進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選。因?yàn)槭请S機(jī)整合,也有不確定因素,有些公司還能提供定點(diǎn)整合技術(shù),將靶基因定點(diǎn)整合到基因組特定的部位,從而保證其高效表達(dá)并且對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生隨機(jī)整合可能產(chǎn)生的傷害。
慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)??商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細(xì)胞的感ran。 在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
每種試劑都有其佳反應(yīng)模式,其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),會(huì)造成整板本底高,陽(yáng)性率高。溫育般用濕盒或水浴,ELISA試劑盒反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋。作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器,酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,決定結(jié)果的可靠度。先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),對(duì)濾光片要定期校正;其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,好使用雙波長(zhǎng),個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),個(gè)參比波長(zhǎng),以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。 本試劑盒可以檢測(cè)穩(wěn)定的,細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶,當(dāng)細(xì)胞受損時(shí),這種酶會(huì)被釋放出來(lái)?;钚詸z測(cè)試劑盒
在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候,為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性,MTT 吸光度盡量在0-0.7 范圍內(nèi)。內(nèi)切酶
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)1.靈敏度高:靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析能夠檢出放射性免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無(wú)法檢出的物質(zhì),對(duì)疾病的早期診斷具有十分重要的意義。2.寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍:發(fā)光強(qiáng)度在4-6個(gè)量級(jí)之間,與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色酶聯(lián)免疫分析吸光度(OD值)2.0的范圍相比,優(yōu)勢(shì)明顯。雖然同位素放射免疫也有較寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍,但是放射性限制其應(yīng)用。3.光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng):化學(xué)發(fā)光免疫分析的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一tian,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作及測(cè)量。4.分析方法簡(jiǎn)便快速:絕大多數(shù)分析測(cè)定jin需加入一種試劑(或符合制劑)的一步模式。5.結(jié)果穩(wěn)定、誤差?。簶颖颈旧戆l(fā)光,不需要額外光源,避免了外來(lái)因素的干擾(光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器),分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。6.安全性好及使用期長(zhǎng):到目前為止還未發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的危害性;另外這些試劑穩(wěn)定,保存期可達(dá)一年之久。內(nèi)切酶
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1、原代細(xì)胞:ScienCell(中國(guó)區(qū)正規(guī)一級(jí)代理)人源和動(dòng)物源各種原代細(xì)胞。
2、培養(yǎng)基:原代細(xì)胞**低血清、無(wú)血清、無(wú)異源蛋白無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞培養(yǎng)試劑:胎牛血清、原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、ELISA試劑盒、定量PCR芯片試劑盒、DNA/RNA及細(xì)胞裂解物等。
4、細(xì)胞系(株):種類豐富(1000余種),已通過(guò)STR鑒定;提供細(xì)胞株完全培養(yǎng)基。
5、自研產(chǎn)品:支原體檢測(cè)/qing除試劑盒、端粒酶檢測(cè)試劑盒、人源/動(dòng)物源ELISA試劑盒等系列產(chǎn)品。
6、技術(shù)服務(wù):綠/紅色熒光蛋白標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、慢bing毒介導(dǎo)基因沉默或過(guò)表達(dá)及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建,細(xì)菌基因敲除、細(xì)胞基因敲除、小鼠基因敲除、血管生成功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。