慢病毒(Lentivirus)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,它能夠?qū)谢驅(qū)氲揭恍┹^難轉(zhuǎn)染的細胞,如原代細胞等,并且將靶基因隨機整合到宿主的基因組中,從而大da增加了轉(zhuǎn)染效率,并且能夠在細胞系中穩(wěn)定表達若干代,可以進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選。因為是隨機整合,也有不確定因素,有些公司還能提供定點整合技術(shù),將靶基因定點整合到基因組特定的部位,從而保證其高效表達并且對細胞不產(chǎn)生隨機整合可能產(chǎn)生的傷害。
慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感ran。 慢病毒攜帶的基因組可整合到宿主基因組,使宿主細胞長時間穩(wěn)定表達外源基因。無機鹽離子檢測試劑盒
就eGFP而言,相對于GFP,其熒光強度更強、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。mCherry是從DsRed演化來的性能*好的一個單體紅色熒光蛋白,可以和GFP系列熒光蛋白共用,實現(xiàn)多色標(biāo)記。熒光蛋白活性和被融合的目標(biāo)蛋白功能相互沒有明顯影響。這些熒光標(biāo)簽蛋白,其融合表達目的蛋白后具有以下優(yōu)點:1.不用破碎組織細胞和不加任何底物,直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光,實時顯示目的基因的表達情況,而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定,被譽為活細胞探針。2.其自發(fā)熒光,不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。3.同時細胞內(nèi)的其它產(chǎn)物不會干擾標(biāo)簽蛋白檢測,從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性。4.其低消耗、高靈敏度檢測,十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn)eGFP表達標(biāo)簽被廣fan地應(yīng)用于基團表達調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。5.mCherry紅色熒光蛋白在標(biāo)記病毒顆粒,研究病毒和宿主細胞之間更有得天獨厚的優(yōu)勢。如用mRFP或mCherry標(biāo)記HIV病毒顆粒,研究HIV和宿主細胞問的相互作用以及HIV侵染宿主細胞的過程.用mRFP標(biāo)記慢病毒顆粒,研究慢病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制過程等。慢病毒熒光亮度更高,熒光偶聯(lián)物特異性好,熒光溢出效應(yīng)減弱。
細胞凋亡晚期,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被染色。
常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感ran分裂期細胞,而且容量有限,腺病毒一般不能整合到染色體上,只能進行瞬時感ran。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相比,慢病毒(LV)具有可以感ran非分裂期細胞、容納外源性基因片段大,可以長期表達等xian zhu優(yōu)點。慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細胞免疫應(yīng)答,可作為一種體外基因運輸?shù)墓ぞ?。慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達能持續(xù)數(shù)月,且無可觀察到的病理學(xué)現(xiàn)象。
對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞,通過病毒介導(dǎo)的實驗?zāi)軌虼骴a提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,以達到目的基因的高效瞬時表達。 這些試劑盒旨在為各種樣品類型的AB、tau和α-突觸核/蛋白提供準(zhǔn)確、靈敏和快速的蛋白質(zhì)定量。
在酶聯(lián)免疫實驗操作中,加樣是必不可少的項步驟,這步驟在整個實驗中都有著很大的影響。那么酶聯(lián)免疫加樣步驟問題應(yīng)如何解決處理呢?
一、加樣問題的可能原因
1.血清或血漿標(biāo)本分離不好即進行加樣;
2.手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入孵箱等待時間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時);
3.加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出孔外。
二、解決方法
1.標(biāo)本為血清:將血液先自然存放1-2小時后,再用3000rmp離心15分鐘;標(biāo)本為血漿:必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管,**后必須立即顛倒**管混合5-10次,放置段時間后,3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測,可放在2-8℃冰箱中,若要貯存,則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。
2.加樣后及時放入孵箱。
3.加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。
4.如果采用AT或其他全自動加樣,選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。
5.標(biāo)本較多時,請分批操作。
小建議:在整個操作過程中必須保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸,實現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動化,有效提高檢測質(zhì)量。
幾乎不受環(huán)境pH影響。FLNb試劑盒CCK-8法的檢測靈敏度很高,甚至可以測定較低細胞密度。無機鹽離子檢測試劑盒
來自蛋白質(zhì)的生物熒光,如綠色熒光蛋白(GFP)可能已經(jīng)在水母等生物中存在了數(shù)百萬年。直到20世紀(jì)60年代,科學(xué)家才開始真正研究綠色熒光蛋白,并推斷出它的生化特性。現(xiàn)在,GFP及其熒光衍生物已成為實驗室的主要研究對象。GFP被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)科的研究,包括:標(biāo)記基因以闡明其表達或定位,作為生物傳感器或細胞標(biāo)記,研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,可視化啟動子活性等等。
GFP是一種由238個氨基酸組成的大約27kda的蛋白,來源于水晶水母Aequorea victoria。它的熒光發(fā)射波長在可見光譜的綠色部分(因此得名),這是由于蛋白中心的三個特定氨基酸(Ser65、Tyr66和Gly67)成熟反應(yīng)形成的發(fā)色團。第yi次發(fā)現(xiàn)時,GFP*令人覺得不可思議的一點是發(fā)色團自發(fā)形成,不需要額外的輔助因子、底物或酶活性——它只需要在成熟過程中存在氧氣。這意味著該蛋白可以直接從維多利亞藻中提取,并在任何生物體中表達,同時仍然保持熒光。 無機鹽離子檢測試劑盒
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1、原代細胞:ScienCell(中國區(qū)正規(guī)一級代理)人源和動物源各種原代細胞。
2、培養(yǎng)基:原代細胞**低血清、無血清、無異源蛋白無動物成分培養(yǎng)基。
3、細胞培養(yǎng)試劑:胎牛血清、原代細胞轉(zhuǎn)染試劑盒、細胞實驗檢測試劑盒、細胞生長因子、ELISA試劑盒、定量PCR芯片試劑盒、DNA/RNA及細胞裂解物等。
4、細胞系(株):種類豐富(1000余種),已通過STR鑒定;提供細胞株完全培養(yǎng)基。
5、自研產(chǎn)品:支原體檢測/qing除試劑盒、端粒酶檢測試劑盒、人源/動物源ELISA試劑盒等系列產(chǎn)品。
6、技術(shù)服務(wù):綠/紅色熒光蛋白標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、慢bing毒介導(dǎo)基因沉默或過表達及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建,細菌基因敲除、細胞基因敲除、小鼠基因敲除、血管生成功能學(xué)實驗。