隨著各型肝炎、肝硬化、肝等慢性肝病的發(fā)病率日益升高，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞也被普遍地用千肝病基礎(chǔ)研究中。盡管細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷改進(jìn)和成熟，國(guó)內(nèi)外也先后建立了多株人肝細(xì)胞系，但體外分離和培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞仍是非常有價(jià)值的研究材料。一材料與設(shè)備1.設(shè)備與器材超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、－70℃冰箱、－20℃冰箱。2.無(wú)菌材料大培養(yǎng)皿、青霉素小瓶、50ml離心管、刻度吸管、彎頭吸管、T25培養(yǎng)瓶、手術(shù)剪、刀、鏤、細(xì)胞篩（100目）、消毒用乙醇棉球、流產(chǎn)胚胎、高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青／鏈霉素、D-Hanks溶液、0.25％胰蛋白酶/0.03%EDTA消化液。原代肝細(xì)胞的定制尺寸。歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！重慶臍帶原代肝細(xì)胞培養(yǎng)技巧
細(xì)胞傳代的基本原則代謝的有毒物質(zhì)會(huì)隨時(shí)間在細(xì)胞培養(yǎng)液中累積。當(dāng)擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)，尤為重要的是經(jīng)常更換培養(yǎng)液以維持細(xì)胞健康和監(jiān)測(cè)細(xì)胞擴(kuò)增情況以避免細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。傳代的細(xì)胞通常分為三個(gè)主要類型：腫瘤細(xì)胞系、永生化細(xì)胞系、干細(xì)胞系。永生化細(xì)胞系是那些來(lái)自多細(xì)胞生物的細(xì)胞通過(guò)一些突變修飾改變了細(xì)胞周期調(diào)控從而可以無(wú)限繁殖的細(xì)胞。與永生化的細(xì)胞系相反，干細(xì)胞系通常從成人和胚胎組織的可自我更新的多能細(xì)胞中分離得到。這些細(xì)胞,如您在短片中看到的人類胚胎干細(xì)胞,在適當(dāng)?shù)臈l件下也能無(wú)限傳代培養(yǎng)。細(xì)胞在優(yōu)化條件下可以懸浮培養(yǎng)，如從血液中分離到的永生化細(xì)胞,或者貼壁培養(yǎng)，如許多從組織中分離的細(xì)胞系。貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)必須仔細(xì)監(jiān)測(cè)以確保細(xì)胞保持健康。根據(jù)細(xì)胞類型，很多貼壁細(xì)胞在其達(dá)到70-90%密度，也就是覆蓋了培養(yǎng)容器表面的70-90%時(shí)需要傳代。要謹(jǐn)記，這些細(xì)胞系雖然保留了原細(xì)胞源的很多特征，但是每次傳代也會(huì)使它們開始產(chǎn)生一些擴(kuò)增細(xì)胞的特有特性。因此，對(duì)任何一個(gè)特定細(xì)胞系，要考慮限制傳代的次數(shù)。 甘肅食蟹原代肝細(xì)胞購(gòu)買原代肝細(xì)胞的服務(wù)廠家。歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！
原代肝細(xì)胞可以懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)。一些細(xì)胞自然地懸浮在懸浮液中，而不附著在表面上（例如，來(lái)源于外周血的細(xì)胞）。也有一些細(xì)胞系經(jīng)過(guò)修飾可以在懸浮培養(yǎng)中存活，它們的生長(zhǎng)密度高于粘附條件所允許的密度。對(duì)于依賴貼壁的原代細(xì)胞，貼壁細(xì)胞（例如實(shí)體組織）需要一個(gè)表面才能在體外正常生長(zhǎng)。這些細(xì)胞大多在沒(méi)有涂層的扁平塑料容器中培養(yǎng)，但有時(shí)在微載體上培養(yǎng)，可以用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如膠原蛋白和層粘連蛋白）包被，以增加粘附特性并提供生長(zhǎng)和分化所需的其他信號(hào)。細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充了適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，并維持在適當(dāng)?shù)臏囟群突旌蠚怏w中（對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常為37°C，5％CO2）。培養(yǎng)條件根據(jù)細(xì)胞類型而普遍變化，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH、葡萄糖濃度、生長(zhǎng)因子和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在可能會(huì)有所不同，具體取決于細(xì)胞類型。
在原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)過(guò)程中有以下幾個(gè)關(guān)鍵操作要點(diǎn)：(1)灌流的溫度。實(shí)驗(yàn)開始前需預(yù)熱PBS緩沖液(含EDTA)及IV型膠原酶，使其溫度保持在37℃，灌流開始時(shí)從水浴鍋中取出。(2)灌流的方向。由于小鼠門靜脈較細(xì)，插管操作較困難，因此采用逆向灌流法，即在較粗的下腔靜脈插管，剪斷門靜脈，使灌流液與血液呈逆向灌流，提高了灌流的成功率及細(xì)胞獲取率[17]。(3)灌流的速度。灌流過(guò)程應(yīng)保持勻速、低速，灌流全程時(shí)間比較好控制在15min以內(nèi)。先灌流無(wú)鈣無(wú)鎂的PBS緩沖液(含EDTA)，灌流速度應(yīng)保持在7～8mL/min。再灌流IV型膠原酶進(jìn)行原位消化，灌注膠原酶時(shí)，采用間斷法，即用鑷子夾閉門靜脈，快速灌注酶至肝臟略膨起后，停頓30s，待液體排出肝臟回縮后，再次進(jìn)行推注，反復(fù)多次，灌注時(shí)間約為5min。(4)膠原酶的濃度。IV型膠原酶濃度為，采用間斷法灌流進(jìn)行原位消化時(shí)，每只小鼠肝臟只需10mL的IV型膠原酶，既提高了灌流效率又可避免膠原酶的浪費(fèi)。(5)鼠尾膠原蛋白I型的濃度。對(duì)于原代肝細(xì)胞體外難以培養(yǎng)的問(wèn)題，不同實(shí)驗(yàn)室建立了多種培養(yǎng)方法來(lái)維持其生物學(xué)活性，大多采用雙層膠原夾層培養(yǎng)法(膠原三明治培養(yǎng)法)[15]，本實(shí)驗(yàn)采用單層膠原培養(yǎng)法，六孔板中預(yù)鋪鼠尾膠原蛋白I型的濃度為。 原代肝細(xì)胞怎么選？上海中喬新舟告訴您。
常見(jiàn)的肝細(xì)胞系有HepG2，Hepa1-6等，HepG2是來(lái)源于一個(gè)15歲白人的肝組織；Hepa1-6來(lái)源于小鼠肝，兩者都屬于永生細(xì)胞系，當(dāng)然也有永生細(xì)胞系具有的通性缺點(diǎn)，如與正常肝臟細(xì)胞相比遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，生物學(xué)特性會(huì)隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而發(fā)生遷移等。原代細(xì)胞是指從機(jī)體獲取組織細(xì)胞后的培養(yǎng)。由于離體時(shí)間短，因此其能夠保持在體內(nèi)的生物學(xué)特性，與細(xì)胞系相比，是更接近體內(nèi)環(huán)境的研究模型。肝臟是作為機(jī)體“”的代謝，其組成是極其復(fù)雜的，除了肝細(xì)胞，還包含眾多內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等組分，各類細(xì)胞功能各異并相互交流，共同決定肝臟的代謝表型。因此，當(dāng)我們要研究某一表型究竟是由于肝細(xì)胞自身的變化引起的，還是由其他細(xì)胞類型所介導(dǎo)的時(shí)，使用小鼠肝臟組織是無(wú)法說(shuō)清問(wèn)題的，使用原代肝細(xì)胞能夠避免其他細(xì)胞的影響，從而得到更加準(zhǔn)確地結(jié)論。原代細(xì)胞相對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，更加可控，可給予的實(shí)驗(yàn)干預(yù)也更多。 原代肝細(xì)胞的服務(wù)價(jià)格更優(yōu)惠。歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！河南兔肝細(xì)胞(家兔)原代肝細(xì)胞購(gòu)買
選擇 原代肝細(xì)胞有哪些方法？歡迎來(lái)電咨詢上海中喬新舟！重慶臍帶原代肝細(xì)胞培養(yǎng)技巧
肝臟原位灌注法：（為分離肝細(xì)胞的經(jīng)典方法）1，在38度-39度的水浴槽中預(yù)熱hepes緩沖液和膠原酶液，使其在肝內(nèi)達(dá)到37度。2，給大鼠（180-200g）腹腔注射巴比妥鈉100ul/100g，從古靜脈注射肝素1000u，打開腹腔，在門靜脈的肝外5mm處松松的放一個(gè)結(jié)扎線環(huán)，將血管套管插入至肝掌，結(jié)扎，快速切開肝下血管與面壓力過(guò)高，關(guān)注500ml無(wú)鈣hepes緩沖液，流速為30ml/min，數(shù)秒鐘肝臟即變白。3，灌注300ml膠原酶液，流速15ml/min，持續(xù)20min。肝臟腫大。4，切下肝臟。用hepes緩沖液沖洗。切開肝纖維囊，收集消化清洗液被并混入100mlleibovitzL15培養(yǎng)液，該懸液含大量肝細(xì)胞。5，用兩層紗布或60-80um尼龍篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，靜置，使活細(xì)胞沉降20分，室溫下，去除含組織碎屑和死細(xì)胞的上清液。6，低速離心法清洗細(xì)胞50g40s三次以去除膠原酶，破壞的細(xì)胞以及肺肝實(shí)質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞。7，將細(xì)胞收集在培養(yǎng)液F12中（含，10ug/ml牛胰島素，），co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。8，傳代培養(yǎng)：細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，先用BSS洗1-2次，再用1：1的，吸除消化液，輕輕洗細(xì)胞層，加適量培養(yǎng)液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)。通常從一個(gè)大鼠肝中可獲得4*10‘6-6*10’6個(gè)活細(xì)胞。 重慶臍帶原代肝細(xì)胞培養(yǎng)技巧
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1、原代細(xì)胞：ScienCell（中國(guó)區(qū)正規(guī)一級(jí)代理）人源和動(dòng)物源各種原代細(xì)胞。
2、培養(yǎng)基：原代細(xì)胞**低血清、無(wú)血清、無(wú)異源蛋白無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清、原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、ELISA試劑盒、定量PCR芯片試劑盒、DNA/RNA及細(xì)胞裂解物等。
4、細(xì)胞系（株）：種類豐富（1000余種），已通過(guò)STR鑒定；提供細(xì)胞株完全培養(yǎng)基。
5、自研產(chǎn)品：支原體檢測(cè)/qing除試劑盒、端粒酶檢測(cè)試劑盒、人源/動(dòng)物源ELISA試劑盒等系列產(chǎn)品。
6、技術(shù)服務(wù)：綠/紅色熒光蛋白標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、慢bing毒介導(dǎo)基因沉默或過(guò)表達(dá)及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建，細(xì)菌基因敲除、細(xì)胞基因敲除、小鼠基因敲除、血管生成功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。