中國(guó)澳門RPMI1640培養(yǎng)基

    對(duì)于大多數(shù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍內(nèi)都適宜。在生產(chǎn)、配制細(xì)胞培養(yǎng)基的過(guò)程中，滲透壓的測(cè)定較為重要，有助于防止在生產(chǎn)、配制過(guò)程中出現(xiàn)稱量等方面的錯(cuò)誤。反應(yīng)器高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞過(guò)程，在添加碳酸氫鈉的過(guò)程中注意滲透壓的監(jiān)控，防止?jié)B透壓過(guò)高對(duì)細(xì)胞的損害。溫度溫度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基有較大的影響，溫度過(guò)高可引起營(yíng)養(yǎng)成份的降解或破壞，細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、離子強(qiáng)度和電解常數(shù)pKa也可能受到影響。如細(xì)胞培養(yǎng)液中的谷氨酰胺，在高溫條件下降解的速度較快，如35℃貯存時(shí)，放置3天降解25%左右，在4℃貯存3周降解約20%。粘滯性及表面張力含血清細(xì)胞培養(yǎng)液的粘滯性主要是由血清引起的，在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液的粘滯性對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有多大影響；但在生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液的粘滯性則直接影響攪拌轉(zhuǎn)速控制及攪拌剪切力對(duì)細(xì)胞造成的損傷程度。表面張力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有較大的作用，尤其在利用生物反應(yīng)器進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，攪拌和通氣都會(huì)引起泡沫的產(chǎn)生。對(duì)于含血清培養(yǎng)液，由于血清中多種蛋白的存在，攪拌時(shí)產(chǎn)生的氣泡較多，氣泡的上升運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞的損傷程度還有爭(zhēng)議，但氣泡的破裂對(duì)細(xì)胞有明顯的損傷作用。為降低這種損傷。無(wú)酚紅培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)中減少了潛在毒性。中國(guó)澳門RPMI1640培養(yǎng)基

    促使植物材料快速生長(zhǎng)、芽體健壯。本發(fā)明在一較佳示例中可以進(jìn)一步配置為：在s4中，將s3中的無(wú)菌外植體接入增殖培養(yǎng)基中后的培養(yǎng)環(huán)境為在光照強(qiáng)度1500lux條件下，溫度25℃，光照時(shí)間16h；黑暗條件下，溫度23℃，光照時(shí)間8h，培養(yǎng)8～12周。通過(guò)采用上述技術(shù)方案，在該培養(yǎng)條件下能夠有效避免增殖培養(yǎng)階段植物材料出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，植物材料能夠快速適應(yīng)增殖培養(yǎng)基，促使植物材料快速生長(zhǎng)、芽體健壯。本發(fā)明在一較佳示例中可以進(jìn)一步配置為：在s4中，每隔8～12周轉(zhuǎn)接入新的增殖培養(yǎng)基。通過(guò)采用上述技術(shù)方案，經(jīng)過(guò)8～12周后，增殖培養(yǎng)基的效果將會(huì)減弱，植物材料也會(huì)污染增殖培養(yǎng)基，需要及時(shí)更換。本發(fā)明在一較佳示例中可以進(jìn)一步配置為：在s5中，將s4中的繡球組培苗接入生根培養(yǎng)基中后的培養(yǎng)環(huán)境為在光照強(qiáng)度1500lux條件下，溫度25℃，光照時(shí)間16h；黑暗條件下，溫度23℃，光照時(shí)間8h，培養(yǎng)8～12周。通過(guò)采用上述技術(shù)方案，在該培養(yǎng)條件下能夠有效避免生根培養(yǎng)階段植物材料出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，植物材料能夠快速適應(yīng)生根培養(yǎng)基，促使植物材料快速生長(zhǎng)、芽體健壯。本發(fā)明在一較佳示例中可以進(jìn)一步配置為：在s2中，外植體消毒的具體步驟為將樹莓外植體葉片剪去，自來(lái)水沖洗干凈。青?；A(chǔ)培養(yǎng)基供應(yīng)商使用減血清培養(yǎng)基能提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

    一般情況下應(yīng)調(diào)pH比所需值低～，因過(guò)濾**后，pH值會(huì)升高約。8）在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，建議不加或加少量的***，如血清的濃度較低則所加***的量也要相應(yīng)降低一些。9）建議用1NHCl或1NNaOH來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，因?yàn)橛锰妓釟溻c來(lái)調(diào)對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示：圖6-1MEM培養(yǎng)基（SLM，MD611）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓圖6-2199培養(yǎng)基（MD502）在pH值相同情況下所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓培養(yǎng)基**培養(yǎng)基的**方法主要有兩種，高壓**及um微孔濾膜過(guò)濾**。與過(guò)濾相比，高壓**的工作強(qiáng)度小，相對(duì)便宜，失敗率低，但易造成營(yíng)養(yǎng)成分的流失。高壓**某些培養(yǎng)基（如MEM）可進(jìn)行高壓**，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓**后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。為保證高壓**的效果，**設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵，可高壓**的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下完全可達(dá)到**效果及營(yíng)養(yǎng)成分的**小損失，因此不需將**時(shí)間延長(zhǎng)。過(guò)濾**大多數(shù)培養(yǎng)基采用～μm孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾**，并且已成為培養(yǎng)基**的發(fā)展方向。

    以及無(wú)血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基專門針對(duì)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，含有BSS、21種氨基酸、維生素等，***適于多種正常細(xì)胞和腫*細(xì)胞的培養(yǎng)，也用做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。HamF12細(xì)胞培養(yǎng)基含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。F12適用于CHO細(xì)胞，也是無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基中常用的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基將DMEM和F12按照1:1比例混合，混合后營(yíng)養(yǎng)成份豐富，血清使用量也減少。常作為開發(fā)無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無(wú)法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)中使用合成培養(yǎng)基時(shí)必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。**普遍的做法是添加5~10%的血清，這樣才能維持細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖。針對(duì)不同的動(dòng)物細(xì)胞，現(xiàn)已開發(fā)了多種商業(yè)化、個(gè)性化的低血清細(xì)胞培養(yǎng)基配方，營(yíng)養(yǎng)成份更加豐富，血清使用量可降低至1～3%，由此可減少了血清等動(dòng)物來(lái)源成份對(duì)生物制品安全性的影響。（serumfreemedium，SFM）經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無(wú)血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免**污染造成的危害。減血清培養(yǎng)基提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

    3)擬南芥葉片愈傷**的誘導(dǎo)方法：用手術(shù)剪刀剪開長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)菌葉片，用鑷子將其取出擺放在步驟(1)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使傷口接觸培養(yǎng)基；于溫度23-25℃、濕度50-70％、光照強(qiáng)度1500-2500lux、光照和黑暗交替(光照時(shí)間16h、黑暗時(shí)間8h)條件下培養(yǎng)。(4)擬南芥根愈傷**的誘導(dǎo)方法：用鑷子取出無(wú)菌苗的根，用手術(shù)剪刀剪開后平鋪于步驟(2)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同步驟(3)。(5)cs誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)結(jié)果為：擬南芥葉片愈傷**誘導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)6-8d在切口處出現(xiàn)顆粒狀愈傷**，培養(yǎng)24-26d獲得嫩綠色致密的團(tuán)塊狀愈傷**，顆粒狀愈傷**誘導(dǎo)率及愈傷**總誘導(dǎo)率均為100％；擬南芥根愈傷**誘導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)5-7d在切口處開始出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷**，培養(yǎng)20-22d獲得較大體積的淡黃色松脆型愈傷**，且在愈傷**周圍觀察到大量致密分布的白毛，顆粒狀愈傷**誘導(dǎo)率及愈傷**總誘導(dǎo)率均為100％。如圖5所示。對(duì)比培養(yǎng)例5：將cs基本培養(yǎng)基替換為ms基本培養(yǎng)基，其余完全同培養(yǎng)實(shí)例5，ms基本培養(yǎng)基的成分及用量如表1所示。ms誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)結(jié)果為：擬南芥葉片愈傷**誘導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)7-10d在切口處出現(xiàn)顆粒狀愈傷**，培養(yǎng)24-26d獲得嫩綠色致密的團(tuán)塊狀愈傷**，顆粒狀愈傷**誘導(dǎo)率及愈傷**總誘導(dǎo)率均為100％。無(wú)血清培養(yǎng)基適用于需要無(wú)血清環(huán)境的細(xì)胞。江蘇F12培養(yǎng)基進(jìn)口

使用減血清培養(yǎng)基能減少實(shí)驗(yàn)的變異性。中國(guó)澳門RPMI1640培養(yǎng)基

    1/2ms生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果為：中雙11號(hào)油菜種子在1/2ms生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為100％，培養(yǎng)9d的幼苗，表現(xiàn)為植株健壯、平均株高為，葉色濃綠，莖稈粗壯、平均莖中粗為，根系發(fā)達(dá)、平均根數(shù)為(>)、平均主根長(zhǎng)為。如圖3所示。培養(yǎng)實(shí)例3和對(duì)比培養(yǎng)例3的培養(yǎng)結(jié)果比較：中雙11號(hào)油菜種子在1/2cs生長(zhǎng)培養(yǎng)基和1/2ms生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率均為100％；在相同條件下培養(yǎng)9d時(shí)，與1/2ms生長(zhǎng)培養(yǎng)基相比，1/2cs生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的幼苗長(zhǎng)勢(shì)更佳，其株高、根的數(shù)目?jī)?yōu)于1/2ms生長(zhǎng)培養(yǎng)基，莖粗及平均主根長(zhǎng)度與1/2ms生長(zhǎng)培養(yǎng)基相近。如圖3所示。培養(yǎng)實(shí)例4：馬鈴薯無(wú)菌苗培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配制：1/2cs基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/l+植物凝膠8g/l，用超純水溶解，。1/2cs基本培養(yǎng)基的成分及用量如表1所示。培養(yǎng)方法：以克新18號(hào)馬鈴薯為例，將配制好的1/2cs生長(zhǎng)培養(yǎng)基分裝于長(zhǎng)、寬、高9cm的耐高溫培養(yǎng)盒中，選擇生長(zhǎng)旺盛的馬鈴薯脫毒苗，于無(wú)菌環(huán)境下，根據(jù)實(shí)際需要，用手術(shù)剪刀剪取約1cm長(zhǎng)的至少帶有1個(gè)葉芽的莖端或莖段，用彎頭鑷子將其1/3-1/2長(zhǎng)度垂直插入培養(yǎng)基中；于溫度22-23℃、濕度50-70％、光照強(qiáng)度2000-3000lux、光照和黑暗交替(光照時(shí)間14h、黑暗時(shí)間10h)條件下培養(yǎng)。中國(guó)澳門RPMI1640培養(yǎng)基