國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少

美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強度，明顯改進了成像質(zhì)量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少

指示劑是如何負載細胞，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細胞也被指示劑所標(biāo)記，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關(guān)性的活動。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）2PPLUS雙光子顯微鏡多少錢在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例；生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中，它能對樣品進行三維觀察，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價值。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術(shù)的不斷結(jié)合，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。

細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi)，促使該細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細胞。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中，它能對樣品進行三維觀察。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少

使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡成像視野是多少